老年急性腦梗死患者Fibulin-5 miR-210水平與神經功能缺損的相關性研究

沈 雷 張保朝 付國惠

南陽市中心醫院，河南 南陽 473000

腦梗死是由多種因素共同作用誘發的神經系統性疾病，神經功能缺損是患者常見且嚴重的并發癥，減少神經功能缺損程度是急性腦梗死治療的重要目標，故深入剖析可反映急性腦梗死患者神經功能缺損程度的生物學指標十分關鍵[1]。微小RNA(miRNA)屬于單鏈RNA，在諸多疾病診斷及甄別中均有應用，其中miR-210可充分反映腦組織損傷情況[2]。研究過程中還發現，細胞外基質在胚胎發育與微環境的平衡維持中作用顯著，尤以fibulin家族最為突出，fibulin可促進細胞外基質復合物合成，并在彈性纖維與基膜形成過程中發揮關鍵作用[3]。由此考慮，fibulin-5與miR-210是否在腦梗死患者神經缺損病理過程中也扮演重要角色。搜索相關文獻發現，miRNA與急性腦梗死相關研究仍處于動物實驗或細胞學研究階段，而關于急性腦梗死患者miRNA表達的相關研究并不多見，加之miRNA種類較多，以miRNA為切入點探尋miR-210在急性腦梗死患者神經功能缺損過程中的表達意義重大。鑒于此，本研究通過觀察急性腦梗死患者Fibulin-5、miR-210表達及神經功能缺損情況，并分析Fibulin-5、miR-210表達與神經功能缺損之間的關系，旨在指導未來對老年急性腦梗死患者早期神經功能缺損的評估，可能對指導臨床診治有一定積極意義。

1 資料與方法

1．1一般資料在獲取醫院醫學倫理委員會審核通過后，選取2016-01―2019-06南陽市中心醫院收治的急性腦梗死的老年患者64例為研究對象(觀察組)，男36例，女28例；年齡60～78(69.25±2.15)歲；合并高血脂癥25例，高血壓30例，冠心病23例，糖尿病31例(每位患者可不合并或合并單種或多種基礎性疾病)。另選取同期在南陽市中心醫院門診體檢的30例健康老年志愿者為對照組，男17例，女13例；年齡60～80(69.34±2.17)歲。2組受試者性別、年齡等對比無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。

1．2納入、排除標準納入標準：(1)腦梗死符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》中相關診斷標準；(2)年齡≥60周歲；頭顱CT影像學征象及數據確診為腦梗死；(3)患者及其家屬均知悉本次研究目的并自愿簽署知情同意書。排除標準：(1)合并免疫缺陷型疾病、感染、惡病質等疾病；(2)合并其他心腦血管性疾病；(3)既往有腦卒中發病史，且遺留不同程度的神經功能缺損癥狀；(4)合并重要臟器功能障礙患者；合并精神認知功能障礙患者。對照組實驗室檢查資料均有存檔。

1．3方法

1．3．1 神經缺損判定標準：根據美國國立衛生院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)[4]評分評估64例老年急性腦梗死患者神經功能缺損情況，量表評估內容包括11個條目：構音障礙、意識、感覺、視野、上、下肢運動、凝視、忽視癥、共濟失調、語言、面癱，共42分，分值越高表明神經受損越嚴重。根據NIHSS評分判定急性腦梗死患者神經功能缺損情況，NIHSS評分≥15分為神經功能重度缺損，8～14分為神經功能中度缺損，4～7分為神經功能輕度缺損。

1．3．2 實驗室檢查

1．3．2．1 miR-210表達：急性腦梗死患者于入院次日，對照組體檢當天，采集空腹肘靜脈血5 mL，利用TRIzol Reagent RNA試劑盒(美國Invitrogen公司)提取血清總RNA，利用美國THERMO公司生產的ND-1000N紫外光光分度計檢測miR-210表達情況，通過獲取的PCR熒光強度，利用2-△△Ct方法得出miR-210相對表達量。

1．3．2．2 Fibulin-5：急性腦梗死患者于入院次日，對照組體檢當天，采集空腹肘靜脈血5 mL，室溫靜置30 min，以1 500 r/min速度離心20 min，分離上層血清，采用酶聯免疫吸附法及衰老關鍵蛋白5試劑盒(武漢優爾生科技股份有限公司)根據特殊軟件系統檢測 Fibulin-5濃度。上述所有涉及專業的操作均由專業人員按照儀器及試劑盒說明書并在嚴格質控下完成。

2 結果

2．1老年急性腦梗死患者神經功能缺損情況64例急性腦梗死患者經NIHSS量表評估后顯示，NIHSS評分≥15(28.52±3.35)分20例，納入重度組；NIHSS評分8～14(11.25±1.13)分30例；NIHSS分值4～7(5.12±0.72)分14例，納入輕度組。

2.2觀察組與對照組整體Fibulin-5及miR-210表達比較觀察組Fibulin-5表達高于對照組，miR-210表達低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2．3不同神經缺損程度的急性腦梗死老年患者Fibulin-5及miR-210表達比較3組急性腦梗死老年患者Fibulin-5相比，重度組表達最高，后由高至低依次為中度組、輕度組；3組miR-210相比，重度組最低，后由低至高依次為中度組、輕度組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2．4急性腦梗死患者Fibulin-5及miR-210表達與神經功能缺損(NIHSS評分)相關性分析經相關性分析顯示，急性腦梗死患者Fibulin-5與NIHSS呈正相關(r>0，P<0.05)，miR-210表達與NIHSS呈負相關(r<0，P<0.05)。見表3。相關性散點圖見圖1。

表1 觀察組與對照組整體Fibulin-5及miR-210表達比較

圖1 A：Fibulin-5與NIHSS評分相關性散點圖；B：miR-210與NIHSS評分相關性散點圖Figure 1 A：Scatterplot of correlation between Fibulin-5 and NIHSS score；2：Scatterplot of correlation between miR-210 and NIHSS score

表2 不同神經缺損程度的急性腦梗死老年患者Fibulin-5

表3 急性腦梗死患者Fibulin-5及miR-210表達與NIHSS評分之間的相關性 (r)Table 3 Correlation between the expression of Fibulin-5 andmiR-210 and NIHSS score in patients with acutecerebral infarction (r)

2．5Fibulin-5及miR-210表達預測急性腦梗死患者神經功能缺損進展的價值將急性腦梗死老年患者神經功能缺損狀態作為狀態變量(1=中重度神經功能缺損，0=輕度神經功能缺損)，將Fibulin-5、miR-210表達單獨與聯合檢測結果作為檢驗變量，繪制ROC曲線(圖2)得到Fibulin-5、miR-210單獨與聯合預測的AUC分別為0.980、0.905、0.983，均>0.9，預測價值較高。見表4。

表4 Fibulin-5及miR-210表達預測急性腦梗死患者神經功能缺損進展的價值Table 4 Value of Fibulin-5 and miR-210 expression in predicting the progression of neurological deficitin patients with acute cerebral infarction

圖2 miR-210與NIHSS評分相關性散點圖；A：miR-210對急性腦梗死患者神經功能缺損預測價值的ROC曲線圖；B：Fibulin-5及聯合診斷對急性腦梗死患者神經功能缺損預測價值的ROC曲線圖Figure 2 Scatterplot of correlation between miR-210 and NIHSS score；A：ROC curve of the predictive value of miR-210 for neurological impairment in patients with acute cerebral infarction；B：ROC curve of the predictive value of Fibulin-5 and combined diagnosis on neurological deficit in patients with acute cerebral infarction

3 討論

急性腦梗死患者普遍伴有不同程度的神經功能缺損，致殘率較高[5-6]，針對此類患病群體，若未及時采取有效干預，任由病情發展，即使患病個體生命得以挽回，但患者想要重歸日常生活或工作難度系數較大，由此可見，早期評估急性腦梗死患者神經功能缺損程度，并及時干預，對促進患者良性預后的重要性[7-10]。

Fibulin-5是由成纖維細胞、血管平滑肌等多種細胞分泌的細胞外基質糖蛋白，富含諸多氨基酸，在體內發揮諸多生物學作用，主要體現在如下幾點：(1)遍布在蛋白豐富的組織中，通過與原纖維蛋白-1、彈性蛋白原等結合輔助并加速彈性纖維合成，發揮促纖維合成作用；(2)Fibulin-5會隨彈性纖維形成終結后下調，但當機體彈性纖維組織損傷后而被激活，并參與彈性組織的合成過程；(3)參與內皮細胞增殖與遷徙，促進肉芽組織增生與Ⅰ型膠原合成來達到加速切口愈合的目的[11-14]。(4)在維持血管穩定方面價值顯著：a、整合素與RGD序列結合使得內皮細胞彼此之間及其與細胞外基質之間的黏附力增強，纖連蛋白的重要受體--α5β1整合素可刺激活性氧簇的表達，因此腦缺血性疾病患者體內纖連蛋白表達升高也會連帶ROS出現高表達狀態；b、Fibulin-5可與α5β1整合素競爭性結合，并抑制ROS低表達，繼而降低缺血缺氧條件下神經元與內皮細胞凋亡[15-18]。一般情況下，Fibulin-5呈低表達，但當機體出現血管損傷、動脈硬化斑塊激活，則內皮細胞中Fibulin-5表達將顯著升高[19-21]。本研究顯示急性腦梗死患者Fibulin-5表達較高，表明Fibulin-5表達極有可能參與了急性腦梗死病程進展。

miRNA擁有17～25個核苷酸單鏈RNA分子，保守性、組織特異性、時序性均較高，可通過誘發靶mRNA翻譯與降解抑制，繼而調控轉錄后基因沉默，介導蛋白質表達，在神經系統增殖、分化、發育及疾病進展中均具有舉足輕重的地位[22-25]。miR-210屬于一種缺氧激活因子，是體外實驗中缺氧條件下唯一一個可被上調的miRNA，并在低氧環境下介導細胞調控過程，在缺血性腦部疾病中具有重要意義[26-28]。本研究顯示觀察組miR-210表達較對照組低，表明急性腦梗死發病可造成miR-210表達降低。分析可能原因，miR-210可被低氧因子誘導，當個體罹患急性腦梗死時，腦組織缺血缺氧，只有miR-210表達降低才能在低氧狀態下得以暴露，被低氧誘導因子辨識成功后誘導、轉錄[29-31]。

綜合Fibulin-5及miR-210生物學特性推測，在急性腦梗死患者病情進展中，Fibulin-5、miR-210的表達可能與神經功能缺損之間也存在某種密不可分的關系。本研究進一步經相關性檢驗發現，急性腦梗死患者Fibulin-5與NIHSS評分呈正相關，miR-210表達與NIHSS評分呈負相關，初步證實上述猜測。為進一步驗證Fibulin-5及miR-210表達與急性腦梗死患者神經功能缺損的關系，本研究ROC曲線顯示，Fibulin-5及miR-210單獨及聯合預測急性腦梗死患者神經功能缺損程度的AUC分別為：0.985、0.905、0.983，均>0.9，預測價值均較高，最終驗證了上述猜測。由此考慮，在未來臨床可通過適時檢測急性腦梗死患者Fibulin-5及miR-210表達，并以此評估急性腦梗死患者神經功能缺損情況，并對異常表達患者及時給予針對性干預，旨在通過調控急性腦梗死患者Fibulin-5及miR-210表達，以達到延緩急性腦梗死患者神經功能缺損進展的目的[32-33]。本研究在分析急性腦梗死老年患者Fibulin-5、miR-210表達情況與神經功能缺損程度上取得初步進展，但因樣本數量有限，加之未對兩個主要指標之間的關系進行深入分析，還需在未來展開大樣本、前瞻性、長時間的深入性研究加以驗證，旨在為改善急性腦梗死患者神經功能缺損提供新的切入點。

Fibulin-5、miR-210在急性腦梗死患者中普遍呈異常表達，其中Fibulin-5過表達、miR-210低表達可能參與了急性腦梗死患者的神經功能缺損進程，且對預測評估患者神經功能缺損進展有一定價值。