AT1R及MCP-1基因多態性與腦梗死患者預后的相關性分析

常 升 王 銘 奚 志 白宏英 楊霄鵬△

1)鄭州市惠濟區人民醫院，河南 鄭州 450053 2)鄭州大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450003

老年人易患多種腦血管疾病，隨著中國人口老齡化的增加，發病率逐漸增加，尤其是腦梗死(CI)，發病率和病死率高。缺血性腦梗死的發作主要歸因于一系列血液循環障礙，導致腦缺血性壞死或腦組織軟化。一旦發生缺血性腦梗死，如未及時有效的治療，會迅速發展并造成嚴重后果[1-2]。CI是神經內科常見的急危重病癥，是因顱腦局部血循環障礙引起，通常發病突然，病情危重，變化快，有著較高病死率和致殘率。腦梗死的病因涉及高血壓、糖尿病、高脂血癥、血管炎、動脈粥樣硬化和遺傳因素等。多種因素研究表明[3]，CI的病理生理變化較復雜，遺傳因素有著重要作用和影響。當前，臨床研究的CI有關候選基因已達到數十種。近年來，研究發現AT1R、MCP-1基因多態性會影響到血漿水平[4]，認為此種異常表達和缺血性心腦血管病有著密切關系。

血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)對心血管和腎臟系統的病理生理至關重要[5]。過量會引起炎癥/氧化反應、高血壓、內皮功能障礙和血管重塑；各種研究表明，血管緊張素受體1亞型(AT1R)起介導的作用。AT1R基因表達的增加有助于高血壓和其他相關心腦血管異常的發作[6]。趨化因子在選擇性募集單核細胞，嗜中性粒細胞和淋巴細胞以及通過激活G蛋白偶聯受體誘導趨化性中起主要作用[7]。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1/CCL2)是調節單核細胞/巨噬細胞遷移和浸潤的關鍵趨化因子之一[8]。MCP-1除了被認為是將單核細胞和巨噬細胞吸引到炎癥位點的有效介體外，還通過血腦屏障介導炎癥細胞的跨內皮遷移，并通過在體內形成趨化梯度來調節局部炎癥反應[9]。

但關于兩者和CI預后的相關性的研究報道還不多。本文應用PCR-RFLP技術測定AT1R及MCP-1基因多態性，并系統剖析與患者預后的相關性。

1 資料與方法

1．1一般資料以鄭州市惠濟區人民醫院神經內科2018-01—2019-10收治的145例CI患者作為研究對象，均經臨床癥狀、輪腦影像學等檢查確診，符合CI的相關診斷標準[10]。臨床表現主要是頭痛、失語、偏癱、嘴角歪斜等。納入標準：(1)均為首發性缺血性CI，在發病后6 h內送院診治；(2)入院時GCS評分>8分，NIHSS評分<15分；(3)患者及家屬對研究知情并同意；(4)無用藥禁忌證。排除合并冠心病、肝腎功能不全、惡性腫瘤、凝血機制障礙、顱腦外傷及不接受隨訪等患者。其中男83例，女62例；年齡52～68(58.6±3.4)歲；發病到入院5～26(9.2±1.4) h。本研究得到醫院倫理委員會批準，且研究流程符合相關規范標準。

1．2方法

1．2．1 臨床治療：本組患者在確診后均給予專科對癥治療，包括行顱壓、抗血凝、吸氧、溶栓、改善側支循環、營養腦神經等；同時，遵醫囑給用依達拉奉(南京先聲東元制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20031342)30 mg+0.9%氯化鈉溶液150 mL，靜注，30 min完成，2次/d，連續用藥14 d[11-12]。

1．2．2 基因多態性檢測：所有患者接受6個月隨訪，在末次隨訪抽取空腹12 h以上晨起外周肘靜脈血5 mL保存于EDTA抗凝血管待檢，通過低滲法將白細胞予以分離，再采用氯仿/異戊醇法完成DNA提取，待進行基因檢測。(1)AT1R A1166C，應用PCR-RFLP技術檢測，對于基因引物設計則參照相關文獻[13]，上游引物：5'-ATAATGTAAGCTCATCCACC-3'，下游引物：5'-GAGATTGCATT TCTGTCAGT-3'，PCR擴增反應相關條件：于94 ℃下預變性2 min，94 ℃變性30 s，退火57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，經過33個循環周期之后于72 ℃下延伸5 min，置于4 ℃恒溫下予以保存。加入5 U內切酶DdeI以及酶切緩沖液，置于37 ℃水中浴12 h酶切反應，應用2.5%瓊脂糖凝膠電泳，予以溴化乙錠染色，再置于紫外燈下進行基因型的鑒定：如2個等位基因上均含內切酶識別位點，且在酶切后產生210 bp、140 bp的片段，則定為CC型；如在酶切之后產生350 bp、210 bp及p140 b的片段，則定義成AC；如不含概酶切位點，僅有350 bp片段，那么定義成AA型。(2)MCP-1 2518基因型。根據MCP-1 全DNA序列，以及有關文獻設計引物[13]，上游引物：5'-TCTCTCACGCCAGCACTGACC-3'，下游引物：5'-GAGTGTTCACATAGGCTTCTG-3'。PCR擴增反應條件：于95 ℃預變性5 min，再轉變成95 ℃變性40 s，退火至0 ℃ 30 s，然后72 ℃延伸40 s，經過30個循環周期之后，再于72 ℃延伸5 min。將擴增產物置于自動凝膠成像系統中觀察擴增情況，以確定PCR產物是所需目的片段(234 bp)，再對目的片段實施限制性酶切：①基本條件：PvuⅡ內切酶1 μL，PCR產物10 μL，去離子水7 μL，緩沖液2 μL，混合均勻后置于37 ℃水中水浴過夜；②基因分型：用2 μL上樣緩沖液溴酚藍與5 μL酶切產物混合均勻后，應用微量吸管把混合液加至凝膠槽孔內；③電泳，經凝膠成像系統觀察確定基因型，僅顯示234 bp片段為AA型，顯示234 bp、159 bp及75 bp片段為GA型，顯示159 bp、75 bp片段為GG型。

1．3評價標準在隨訪6個月后，應用mRs量表評價患者預后，0～6分，無癥狀為0分；雖有癥狀，但無顯著殘障；輕度殘障3分；重度殘障4分，嚴重殘障為5分，6分為死亡。如評分≤1分為預后良好，>1分為預后不良。

1．4統計學處理將本課題研究資料統一錄入Excel進行整理，并應用SPSS 12.0 軟件包完成統計學分析，基因型、等位基因的頻率用%表示，行χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2．1預后情況本組145例患者出院后均接受6個月隨訪，無失訪病例，通過mRs評分，預后良好90例，占62.07%，預后不良55例，占37.93%。

2．2預后良好和預后不良組AT1R基因多態性對比通過對AT1R A1166C基因檢測(圖1)，預后良好組患者AA、AC基因型頻率及C等位基因頻率分別為86.67%、23.33%、5.56%，分別低于預后不良組的45.45%、54.55%及24.55%，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2．3預后良好和預后不良組MCP-1基因多態性對比通過對MCP-1 2518G/A基因檢測(圖2)，預后良好組的GG基因型頻率為27.78%、G等位基因頻率為43.33%，分別低于預后不良組的36.36%、54.55%(P<0.05)。見表2。

表1 預后良好和不良患者的AT1R基因多態性比較 (%)Table 1 Comparison of AT1R gene polymorphism betweenpatients with good and poor prognosis (%)

表2 預后良好和不良患者的MCP-1基因多態性比較 (%)Table 2 Comparison of MCP-1 gene polymorphism betweenpatients with good and poor prognosis (%)

圖1 AT1R PCR擴增產物內切酶酶切后瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of AT1R PCR amplified products after endonuclease digestion

圖2 MCP-1 2518G/A的PCR產物酶切電泳圖Figure 2 PCR products of MCP-1 2518G/A digested by endonuclease and then electrophoretic

3 討論

近年來，隨著現代分子生物學在臨床研究中應用開來，及遺傳學技術、流行病學試驗等研究方法的應用，CI遺傳學的研究不斷深入。當前，用于分析人的基因突變和CI發生及預后的遺傳流行病學研究主要是關聯分析法，針對群體病例進行對比研究。人類基因組內的遺傳多態性大多數表現出重復序列和普遍性單核苷酸多態性(SNP)。所謂SNP就是在基因組內特定核苷酸所在位置存在的2種不同堿基置換，一般僅為1種二等位基因或二態遺傳變異，可通過自動化實現批量化檢測，與此同時，因在基因組中SNP的數量極大，分布密而有著很高的穩定性，能夠為臨床提供豐富、多樣的基因遺傳變異信息，所以，將其作為新一代的基因遺傳標記。伴隨人類基因組計劃的不斷完善，學界日益重視基因組SNP，其可充分反應出不同群體、個體間的基因遺傳差異，并基于特定SNP研發和選用敏感藥物，以實現高度個體化的治療和干預，實現理想的治療效果和預后。

AT1R是一種G蛋白偶聯受體，主要存在于血管平滑肌、心臟等組織內，在被血管緊張素II(Ang II)激活之后的效應主要在于平衡機體血壓與水電解質，機體持續性高血壓狀態會導致心腦血管形態學與生理功能發生改變[14]，如左室重塑、血管形態改變、內皮功能損害等。ATlR基因則位于人3號染色體長臂21～25區，A1166C則位于3’未翻譯區57端，A突變成C會出現這三種基因型：一是未突變純合子AA型；二是突變雜合子AC型；三是突變純合子CC型。此位點的突變不會導致其編碼氨基酸序列以及生理功能發生變化，但是可能會參與到基因的轉錄、翻譯的調控中，進而影響到AT1R對于Ang Ⅱ親和力改變。研究表明[15]，AT1R基本介導Ang Ⅱ所有臨床效應，會導致腦動脈、微動脈收縮效應，促進兒茶酚胺釋放，引發血管平滑肌細胞過度肥厚或增生，減小血管腔/壁比值，影響CI病情的改善。本研究中，對AT1R多態性與CI預后相關性開展研究，結果顯示CI預后良好患者的ATlR AA、AC基因型以及C等位基因的頻率整體高于預后不良患者(P<0.05)。由此表明，ATlR AA、AC基因型和CI預后有密切關系，與相關課題研究結論基本一致。

MCP-1會導致單核細胞與巨噬細胞的胞漿內游離Ca2+水平增高，表達粘附分子，釋放溶酶體酶以及超氧陰離子、組織因子以及促炎細胞因子，致單核/巨噬細胞激活和聚集，而加重血管腔內的脂質積累，促使動脈血管內膜組織細胞增生，加快動脈斑塊生長，引發CI，不利于病情改善。臨床上對MCP-1基因進行了諸多研究，但對其2518G/A多態性和動脈粥樣硬化、CI、心梗等缺血性心腦血管病變的預后間的相關性機制尚未完全明確。國外學者SKALNIAK 等[16]人研究發現，MCP-1 2518G/A多態性血漿脂蛋白a(LP(a))的機體含量存在相關性。研究發現[17]，MCP-1 2518GG 基因型人群的LP(a)含量、患心腦血管病變的幾率均顯著高于MCP-1 2518AA基因型人群。高脂蛋白(a)血癥是動脈粥樣硬化、CI發生的主要危險因素。高脂蛋白(a)血癥和MCP-1 2518 GG基因型可能是通過提高MCP-1表達水平，增加白細胞聚集，進而增加動脈粥樣硬化損傷的危險性[18]。但有學者認為，也可能是通過促進脂質過氧化來導致動脈粥樣硬化損傷。研究認為[15-16]，MCP-1 2518G/A多態性可能通過影響MCP-1基因的轉錄、翻譯表達，來參與調控病癥發生發展中的炎性反應，最終對病癥的發生、發展、轉歸產生影響。有些刺激因素效用會誘導產生MCP-1的量表現出顯著的個體性差異，而MCP-1基因-2518G/A多態性會對此轉錄啟動區域的活性產生影響，并和單核細胞MCP-1的產量個體差異表現出一致性。臨床研究發現MCP-1 2518G/A多態性和血漿內的MCP-1水平表現出一定相關性，MCP-1 2518位點基因型為含G(GG，GA)者的血漿內MCP-1的整體水平要高于AA基因型者[19-20]。本研究顯示預后良好和預后不良患者相比，CI患者的MCP-1 2518位點有著較高的G等位基因攜帶頻率(GG，GA)，表明MCP-1 2518G等位基因可能是影響CI轉歸和預后的重要因素。由此推測，人體MCP-1基因2518G/A多態性和CI預后存在一定關系。

AT1R位點A1166C及MCP-1基因位點-2518多態性與CI的預后可能存在相關性，這為探索CI的治療和康復方案、方法的制定提供新的方向和思路。但是因本研究樣本量有限，使得某些基因型頻率整體較少，再加上缺乏區域性對比，會影響到結論的完整性和可靠性，因而，應加大樣本量，選取多區域病例進一步深入研究，以便充實和完善本課題的結論。