自噬增強對缺氧心肌細胞活性的影響

李偉慇

自噬是亞細胞膜結構發生動態變化并經溶酶體介導對細胞內蛋白質和細胞器降解的過程。通過平衡細胞合成和分解代謝,自噬穩定細胞內環境,維持細胞存活。據有關研究,自噬于心肌缺血期和再灌注期起不同作用,缺血初期主要有保護作用,而再灌注期則做成細胞損傷而致死亡。40 多年前,就有關于缺血再灌注后自噬體誘導產生的報道［1］。模擬狀態一過性缺血再灌注可引起自噬泡增加。通過增強自噬作用,胎鼠心臟在無糖培養液中可長達4 h 無損傷。Decker 等［2］發現,離體灌流兔心后再灌注能引起顯著的自噬作用及心功能的恢復,而激起細胞修復過程。上述實驗均證明急性心肌缺血過程中存在自噬,且自噬泡產生與之后心肌功能的恢復是互隨的。但另有研究指出,缺血再灌注過程中的自噬作用,有不利心肌細胞存活的作用,特別在再灌注過程中。通過3-MA 阻斷饑餓誘導的自噬在H9C2 轉化心肌細胞中,能夠降低細胞死亡［3］。因此本課題旨在探討自噬作用增強對缺氧引起的H9C2心肌細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 電子天平為瑞士Mettler Toledo 生產的AL104 電子天平,超凈臺由蘇州凈化生產,中型冷凍臺式離心機Universal 32R Hettich zentrifugen 來自德國Hettich,移液器為德國Eppendorf 制造。MTT：Costar 48孔細胞培養板采用美國CORNING-COSTAR,日本Sanyo細胞培養箱,酶標儀為Labsystems Dragon 的Wellscan MK3 臺盼藍染色：Corning 細胞培養皿為美國Corning生產,顯微鏡為日本Olympus CKX41-A32FL/PH 倒置顯微鏡。

1.1.2 藥品與試劑 DMEM 培養基與0.25%胰蛋白酶均為美國gibco 的產品,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)為武漢博士德生物工程有限公司生產,Rapamycin 購于美國Sigma。MTT：凱基生物生產的MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒KGA311。臺盼藍染色：曲利本蘭購自廣州瑞舒生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養 待H9C2 心肌細胞密度接近90%進行傳代：棄瓶中原液,用PBS 液清洗細胞表面2 次,加0.25%的胰蛋白酶消化液(含EDTA),令消化液恰好覆蓋細胞表面,入37℃CO2孵箱中消化1 min 左右,倒置于顯微鏡下見細胞成片收縮變圓、邊界清楚時,即加入含10%FBS 的DMEM 培養液終止消化,并反復輕輕吹打瓶底,使細胞脫壁,把細胞懸液移入離心管,1100 r/min 離心10 min,棄上清,加入含有10%FBS 的DMEM 培養液重懸細胞。鏡下計數,以1∶3 左右比例分裝接種于新培養瓶中,靜置于37℃的CO2孵育箱中。24 h 后可見細胞重新貼壁生長,換新鮮培養基以去除組織塊與死細胞。

1.2.2 實驗分組 本次試驗用H9C2 轉化心肌細胞來模擬乳鼠心肌細胞,造模：乳鼠心肌細胞。分為Con組(正常培養12 h),C-R1組(正常培養12 h+1 mM rapamycin),C-R10組(正常培養12 h+10 mM rapamycin),C-R100組(正常培養12 h+100 mM rapamycin),C-R1000組(正常培養12 h+1000 mM rapamycin),N組(缺氧12 h),N-R1組(缺氧12 h+1 mM rapamycin),N-R10組(缺 氧12 h+10 mM rapamycin),N-R100組(缺氧12 h+100 mM rapamycin),N-R1000組(缺氧12 h+1000 mM rapamycin)。

1.2.3 實驗方法

1.2.3.1 MTT 在96 孔板加入細胞100 μl/孔(約1×104),置37℃ 5% CO2細胞培養箱培養。然后待細胞密度適合后將需要缺氧的96 孔板放進1% O2細胞培養箱培養12 h。將5×MTT 用 Dilution Buffer 稀釋成1×MTT。每孔加100 μl 1× MTT,37℃孵育4 h,令MTT還原為甲臜。吸出上清液,每孔加150 μl DMSO 使甲臜溶解,用平板搖床搖勻后即可用酶標儀在560 nm波長處檢測每孔的光密度。然后分析細胞存活率,具體方法為將各測試孔的光密度(OD)值減去本底OD 值(完全培養基加MTT,無細胞)或空白藥物孔OD 值(完全培養基加受試藥物的不同稀釋度加MTT,無細胞),各重復孔的OD 值取均數±標準偏差。細胞的存活率以T/C%表示,T 為加藥細胞的OD 值,C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率=(加藥細胞OD/對照細胞OD)×100%。

1.2.3.2 臺盼藍染色 配制4%臺盼藍母液：稱取4 g臺盼藍,加少量蒸餾水研磨,加雙蒸水至100 ml,用濾紙過濾,4℃保存。使用時,用PBS 稀釋至0.4%。然后胰酶消化貼壁細胞,制備單細胞懸液,并作適當稀釋。細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9∶1 混合混勻。(終濃度0.04%)在3 min 內,分別計數活細胞和死細胞。鏡下觀察,死細胞被染成明顯的藍色,而活細胞拒染呈無色透明狀。統計細胞活力：活細胞率=活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)×100%。

1.3 觀察指標 分析MTT、臺盼藍染色細胞存活率。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 5.0 統計軟件處理,存活率采用單因素方差分析(ANOVA),組間比較用LSD 法。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT 細胞存活率分析 正常處理的Con組與C-R10組,C-R100組的存活率比較,差異有統計學意義(P＜0.05),缺氧處理中N-R100組存活率最高,為0.068%。見表1,圖1,圖2。

圖1 正常處理

圖2 缺氧無糖12 h

2.2 臺盼藍染色細胞存活率分析 Con組、C-R1組、C-R10組、C-R100組、C-R1000組比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。N組、N-R1組、N-R10組、N-R100組、N-R1000組比較,差異具有統計學意義(P＜0.05),其中N-R100組存活率最高,為0.058%,與MTT 結果基本吻合。見表2,圖3,圖4。

表2 臺盼藍染色細胞存活率分析(%)

圖3 正常處理

圖4 缺氧無糖12 h

3 討論

細胞在基礎狀態下自噬水平較低,用于維持內環境的穩態；但是當細胞處于營養或能量不足、結構重建以及清除損壞的細胞器等狀態時自噬被顯著激活。從信號調控機制分類自噬的信號途徑分為兩種,其中一種是哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mTOR)依賴性途徑,mTOR 是細胞中ATP 和氨基酸等營養物質的感受器,是細胞自噬的重要調節者。mTOR 的活性受細胞中葡萄糖與氨基酸水平的調節。當細胞中營養充足時,胰島素與受體結合后,通過激活ClassⅠPI3KPI3K-AKT激酶信號通路,繼而活化蛋白激酶mTOR。mTOR 通過抑制自噬相關蛋白Atg1-Atg13 復合物的形成來抑制細胞自噬的發生；當處于饑餓時,mTOR 的活性被抑制,導致Atg 家族成員活化,促進自噬泡的形成。而本次實驗用rapamycin 正是通過抑制mTOR 活性而刺激自噬。由結果可知,通過適量的rapamycin 適度刺激自噬作用發生對缺氧心肌細胞有一定的保護作用。這可能是因為細胞營養不足時,自噬途徑被激活,誘導自噬體形成,并由溶酶體介導降解膜磷脂及胞質內蛋白質等,給細胞提供能量與維持細胞的主要合成代謝。因此它可抑制慢性缺氧導致的凋亡,降低缺氧性心肌損傷,是缺氧過程心肌細胞自我保護的一種機制［4-6］。

綜上所述,本實驗利用H9C2 轉化心肌細胞來模擬乳鼠心肌細胞,采用MTT 與臺盼藍染色來檢查細胞活力,研究自噬增強對缺氧引起的心肌細胞活性的影響。通過本課題的研究可以得出以下結論：適當的自噬增強可保護缺氧引起的心肌細胞損傷。