層黏連蛋白α2缺陷型先天性肌營養(yǎng)不良的臨床與基因分析

何展文 柏 萍 李平甘 吳若豪 陳啟慧 李 宇 羅向陽

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510120

先天性肌營養(yǎng)不良(congenital muscular dystrophy，CMD)是一組自出生時或生后數(shù)月內(nèi)起病的罕見的原發(fā)性和進行性肌病，具有臨床和遺傳異質(zhì)性，主要臨床表現(xiàn)為嬰兒早期出現(xiàn)肌無力、運動發(fā)育遲緩、肌張力低下等[1]。層黏連蛋白α2缺陷型先天性肌營養(yǎng)不良(LAMA2-MD)是CMD最常見的亞型，占所有CMD的1/3，LAMA2-MD與編碼層黏連蛋白2(laminin2)的3個亞單位之一α2鏈(LAMA2，也稱Merosin)基因缺陷有關(guān)[2-3]。肌肉活檢及LAMA2基因檢測可明確其診斷，但至今國內(nèi)基因明確病例并不多見。本研究回顧2010-10—2018-09中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院確診3例LAMA2-MD的臨床特點和基因結(jié)果，探討臨床表現(xiàn)以及基因檢測對診斷的作用。

1 資料與方法

1．1診斷標(biāo)準(zhǔn)LAMA2-MD診斷主要根據(jù)臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，主要臨床表現(xiàn)包括出生時至嬰兒早期出現(xiàn)肌無力、肌張力減低，運動發(fā)育落后，關(guān)節(jié)攣縮，智力多正常，血清肌酸激酶水平增高。確診經(jīng)肌肉活檢病理和基因檢測，肌肉病理免疫組化染色提示Merosin完全缺失或部分表達，或基因檢測到兩個致病性等位LAMA2基因突變[3]。

1．2研究方法

1．2．1 頭顱影像學(xué)檢查：采用Philips Intera 1.5 T超導(dǎo)MR儀，仰臥位，行頭顱平掃和增強檢查，常規(guī)SE序列T1WI(TR 450 ms，TE 15 ms)成像，T2WI(TR 2 000 ms，TE 120 ms)成像，層厚5 mm，間隔0.5 mm，矩陣256×256，F(xiàn)OV 230 mm×230 mm，采用Gd-DTPA(劑量0.2 mL/kg體質(zhì)量)對比劑，分別行橫軸位和冠狀位、矢狀位檢查。

1．2．2 肌肉病理：首先向患兒家屬交代病情和手術(shù)相關(guān)事項，簽署同意書。選擇小腿腓腸肌行開放性活檢。肌肉標(biāo)本分成兩部分，一部分經(jīng)異戊烷預(yù)冷后放入液氮中固定，冰凍切片，切片厚度8 μm。分別進行組織學(xué)和組織化學(xué)方法染色，包括蘇木精-伊紅(HE)染色、改良 Gomori三色(MGT)染色、還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶(NADH-TR)染色、高碘酸 Schiff反應(yīng)(PAS)染色、油紅O染色、琥珀酸脫氫酶(SDH)染色、細(xì)胞色素C氧化酶(COX)和染色SDH/COX雙染。另一部分肌肉在2%戊二醛中固定，1%鋨酸后固定，常規(guī)脫水和塑料包埋，超薄切片，鉛鈾雙染色，電鏡下觀察。

1．2．3 肌肉標(biāo)本免疫組化：單克隆一抗包括抗萎縮蛋白(Dystrophin)-Rod、Dystrophin-C、Dystrophin-N、Dysferlin、α/β/γ/δ-肌聚糖(sarcoglycan)、層黏連蛋白(Merosin)及膠原蛋白Ⅵ(Collagen Ⅵ)抗體，免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉卵白素-生物素法染色試劑盒。

1．2．4 致病基因檢測：收集患兒及父母外周血標(biāo)本，提取DNA，二代基因測序檢測遺傳性肌營養(yǎng)不良基因，多重鏈接探針擴增技術(shù)(MLPA)檢測LAMA2基因缺失或重復(fù)。

2 結(jié)果

2．1臨床表現(xiàn)確診層黏連蛋白α2鏈缺陷型先天性肌營養(yǎng)不良患兒共3例(表1)，男2例，女1例。所有患兒均為生后起病，表現(xiàn)為運動里程碑落后，近端肌無力為主，肌張力低下。例2能獨走，但走路不穩(wěn)，上樓梯困難，其余2例患兒最大運動能力為獨坐。語言發(fā)育與智力均正常。3例患兒營養(yǎng)狀態(tài)不良，體質(zhì)量低下。例1有脊柱側(cè)彎，例1和例3有關(guān)節(jié)攣縮(肩、肘、膝和踝關(guān)節(jié))。血清肌酸激酶(CK)中度升高(895～1 414 U/L)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)輕中度升高(34～94 U/L)。所有患兒行心電圖檢查均無異常。

表1 3例層黏連蛋白α2鏈缺陷型先天性肌營養(yǎng)不良患兒的臨床特點Table 1 Clinical characteristics in 3 patients with LAMA2-MD

2．2腦電圖與頭顱磁共振檢查所有患兒行腦電圖及頭顱MRI檢查。3例患兒腦電圖檢查示正常小兒腦電圖。3例患兒頭顱MRI檢查均示雙側(cè)大腦半球白質(zhì)區(qū)對稱多發(fā)斑片狀、片狀異常信號灶，T1WI上呈稍低信號(圖1A)，T2WI上呈高信號(圖1B)，F(xiàn)LAIR上呈高信號(圖1C)，增強未見明顯強化(圖1D)；內(nèi)囊、胼胝體、基底節(jié)、丘腦、小腦及腦干均無受累，側(cè)腦室、第三、第四腦室形態(tài)、信號未見異常。

2．3肌電圖、肌肉病理及免疫組織化學(xué)檢查全部病例行肌電圖檢查，肌電圖檢查均提示肌源性損害，表現(xiàn)為周圍神經(jīng)運動傳導(dǎo)波幅低，時限縮短。病例2和病例3進行肌肉組織病理檢查。肌肉病理組織學(xué)HE染色顯示肌纖維大小不等，可見散在分布少許壞死伴吞噬纖維及再生纖維；可見較多高收縮纖維，未見內(nèi)核纖維增多；肌間質(zhì)未見炎細(xì)胞浸潤，肌間及肌內(nèi)膜結(jié)締組織明顯增生(圖2A)。電鏡檢查示部分肌纖維內(nèi)肌原纖維排列紊亂，局部見灶狀肌溶灶及萎縮肌纖維，局部脂質(zhì)空泡增多、糖原未見增多，未見桿狀體改變，未見異常管聚集現(xiàn)象；未見異常線粒體堆積，肌間質(zhì)膠原纖維增生，未見炎細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管基底膜未見明顯增厚(圖2B)。病例2免疫組織化學(xué)染色顯示Merosin部分肌纖維膜表達減弱，局灶缺失(圖2C)；病例3免疫組織化學(xué)染色顯示Merosin表達明顯減弱或缺失(圖2D)。Dystrophin-Rod/C/N、Dysferlin、Collagen Ⅵ和α/β/γ/δ-sarcoglycan均完全正常，表達連續(xù)、均勻。

圖1 層黏連蛋白α2鏈缺陷型先天性肌營養(yǎng)不良患兒頭顱MRI表現(xiàn)，腦實質(zhì)結(jié)構(gòu)對稱，腦室不大，雙側(cè)大腦半球白質(zhì)信號異常，A：T1WI上呈稍低信號(冠狀位)；B：T2WI上呈高信號(橫斷位)；C：FLAIR上呈高信號(冠狀位)；D：增強未見明顯強化(橫斷位)Figure 1 Skull MRI manifestations in patients with LAMA2-MD.The parenchymal structure of the brain is symmetrical，the ventricles are small，and the white matter signals of the cerebral hemispheres are abnormal.A：Slightly low signal on T1WI (Coronal position)；B：High signal on T2WI (Transverse position)；C：High signal on FLAIR (Coronal position)；D：No obvious enhancement in enhancement (Transverse position)

2．4基因檢測病例1檢測到LAMA2基因(NM_000426.3)1個雜合變異為50號外顯子區(qū)域c.7147 C>T雜合突變，該突變?yōu)闊o義突變(p.Arg2383*)，導(dǎo)致編碼產(chǎn)物氨基酸序列提前終止，該突變來自于其父親；另一突變?yōu)?6號外顯子區(qū)域c.6513_6515微缺失突變，引起所編碼的蛋白質(zhì)第2172位的氨基酸殘基Val缺失，該突變來自于其母親；此復(fù)合突變?yōu)橐褕蟮赖闹虏⊥蛔儭２±?檢測到LAMA2基因(NM_000426.3)2個雜合變異，一個為46號外顯子區(qū)域c.6513_6515微缺失突變，引起所編碼的蛋白質(zhì)第2172位的氨基酸殘基Val缺失，該突變來自于其母親；另一突變?yōu)?7號內(nèi)含子區(qū)域發(fā)生雜合突變c.2451-6A>G；p.?，該突變來自于其父親，為國際上尚未報道的新發(fā)突變，未知意義。應(yīng)用MLPA技術(shù)對LAMA2基因分別進行檢測結(jié)果未見異常。病例3檢測到LAMA2基因(NM_000426.3)2個雜合變異，一個為46號外顯子區(qū)域c.7810C>T雜合突變，為無義突變(p.Arg2604*)，導(dǎo)致編碼產(chǎn)物氨基酸序列提前終止，該突變來自于其母親，此突變?yōu)榧韧鶊蟮赖闹虏⊥蛔?；另一突變?yōu)?4號內(nèi)含子區(qū)域發(fā)生雜合突變c.3556-13T>A，該突變產(chǎn)生一個新的剪接受體位點，引起編碼產(chǎn)物氨基酸序列提前終止，來自于其父親。應(yīng)用MLPA技術(shù)對LAMA2基因分別進行檢測結(jié)果未見異常。

3 討論

LAMA2-MD又稱Merosin缺陷型先天性肌營養(yǎng)不良1A型(MDC1A)，是一種常染色體隱性遺傳性肌營養(yǎng)不良，是最常見的先天性肌營養(yǎng)不良(CMD)，全球患病率(1～9)/10萬人，歐美國家多見，在先天性肌營養(yǎng)不良中約占1/3[2，4-8]。LAMA2-MD發(fā)病的主要機制是肌肉層黏連蛋白α2的完全或部分缺乏。當(dāng)層黏連蛋白α2有缺陷或缺失時，肌肉纖維受到機械應(yīng)力，容易撕裂和斷裂，導(dǎo)致組織損傷和變性[9]。LAMA2-MD其特征是出生時或出生后6個月內(nèi)發(fā)病，表現(xiàn)為嚴(yán)重的肌無力和肌張力低下，以近段肌力低下為主，面肌受累出現(xiàn)吮吸無力，部分出現(xiàn)關(guān)節(jié)攣縮[10-15]。大多數(shù)患兒的運動發(fā)育里程碑延遲，2～3歲時會獨坐，很少有人獲得獨立的行走[16]。LAMA2-MD的臨床表現(xiàn)取決于層黏連蛋白α2缺乏的程度。層黏連蛋白-α2的完全缺失表現(xiàn)為嚴(yán)重的早發(fā)性CMD，而層黏連蛋白-α2的部分缺失則癥狀較輕，獲得獨走能力[17-19]。本組病例2肌肉病理示Merosin部分肌纖維膜表達減弱，局灶缺失，其起病相對較晚，癥狀也較輕，最終能獨立的行走。病例3肌肉病理示Merosin表達明顯減弱或缺失，出生后即出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀，吮吸無力，發(fā)育里程碑落后，僅能獨坐。本組3例患兒營養(yǎng)狀態(tài)不良，體質(zhì)量低下。喂養(yǎng)困難、吞咽異常和咀嚼困難是影響LAMA2-MD患兒體質(zhì)量增加不良的原因。此外，反復(fù)感染進一步加劇了這一問題[20]。大多數(shù)早發(fā)性LAMA2-MD患兒體質(zhì)量低于第三百分位，有些患兒需要腸內(nèi)喂養(yǎng)以滿足其營養(yǎng)需求[21-22]。

LAMA2-MD患兒精神狀況正常，可有輕微智能發(fā)育遲滯或癲癇，言語認(rèn)知功能通常正常，僅少數(shù)智力發(fā)育落后或合并癲癇，少數(shù)大腦皮質(zhì)發(fā)育不良患兒伴難治性癲癇[23-24]。本組患兒智能發(fā)育均正常，腦電圖檢查均示正常兒童腦電圖。層黏連蛋白-α2廣泛分布于橫紋肌的肌膜，同時也表達于腦血管的基膜及施萬細(xì)胞基底膜，這種表達方式正是LAMA2-MD腦及周圍神經(jīng)系統(tǒng)病理基礎(chǔ)[21]。6個月大的患者中可以觀察到頭顱典型腦白質(zhì)病變，1歲后穩(wěn)定無變化，這種表現(xiàn)對診斷很有幫助。本組3例患兒頭顱MRI表現(xiàn)與既往報道一樣，主要累及腦室旁和皮層下白質(zhì)，而胼胝體和內(nèi)囊不受累，呈長T1、長T2信號，F(xiàn)LAIR上呈高信號。這種改變可能缺陷影響血腦屏障的成熟和(或)功能的改變，腦血管基膜對水通透性增加，大腦含水量的變化有關(guān)[25]。此外，層黏連蛋白-α2在施萬細(xì)胞基底膜均有表達，有報道其缺陷能影響周圍神經(jīng)髓鞘形成引起運動感覺神經(jīng)病變，但臨床意義不大[26]。

LAMA2-MD的致病基因LAMA2定位于6q22-23，包含65個外顯子，編碼分子量為390 000的laminin-α2[3]。LAMA2基因分子遺傳學(xué)檢測是確診LAMA2-MD的最有效的方法，檢測手段包括NGS聯(lián)合MLPA、aCGH等[27]。LAMA2基因突變類型復(fù)雜多樣，主要包括無義突變(32%)、微小缺失或插入(19%)、剪切突變(15%)、錯義突變(12%)、拷貝數(shù)變異(20%)等[28-29]。兩個LAMA2基因的功能缺失突變能導(dǎo)致更嚴(yán)重的早發(fā)型LAMA2-MD，這些突變分布在LAMA2編碼區(qū)，55%聚集在14、25、26和27號外顯子[17]。另一方面，錯義突變、框內(nèi)缺失和剪接位點突變常與晚發(fā)型LAMA2-MD相關(guān)，在這些病例仍然可以檢測到層黏連蛋白-α2的殘留表達。GERANMAYEH等[17]報道病例中2名患兒LAMA2基因拷貝雖然功能完全缺失，其臨床表型卻較溫和，能夠獨立行走，不需要喂養(yǎng)或通氣支持。本研究中病例1是既往已經(jīng)報道過的臨床病例[30]。病例2、3雖然根據(jù)肌肉活檢組織病理檢查所見已做出臨床病理診斷，但結(jié)合免疫組織化學(xué)染色和LAMA2基因突變分析對明確診斷十分必要。2名患兒通過基因檢查都檢出2個LAMA2基因突變，分別來自于父親和母親的致病基因，符合常染色體隱性遺傳遺傳方式。病例2檢出的一個突變是6號外顯子區(qū)域c.6513_6515微缺失突變，為朱艷慧等[31]于2014年報道的致病突變，引起所編碼的蛋白質(zhì)第2172位的氨基酸殘基Val缺失，影響laminin-α2與鈣離子的結(jié)合，從而導(dǎo)致laminin-α2與α-抗萎縮相關(guān)糖蛋白連接受阻。另一突變?yōu)?7號內(nèi)含子區(qū)域發(fā)生雜合突變c.2451-6A>G，此突變?yōu)閲H上尚無報道的新突變，結(jié)合免疫組化結(jié)果分析雖為未知突變，但該位點相對較為保守，推測這種突變能產(chǎn)生了一個新的剪接受體位點，導(dǎo)致編碼提早終止，引起蛋白表達缺失。病例3檢出的一個突變是46號外顯子區(qū)域c.7810C>T雜合突變，為無義突變，引起編碼產(chǎn)物氨基酸序列提前終止。2014年EGL基因診斷、Eurofins臨床診斷已將該突變列為致病突變[27，32]。另一突變?yōu)?4號內(nèi)含子區(qū)域發(fā)生雜合突變c.3556-13T>A，既往43名層黏連蛋白α2缺陷型先天性肌營養(yǎng)不良報道中有2名患而同樣有這種變異，認(rèn)為該突變?yōu)橹虏⊥蛔?，產(chǎn)生一個新的剪接受體位點，引起編碼產(chǎn)物氨基酸序列提前終止[29]。

LAMA2-MD致殘率和致死率高，預(yù)后差，目前缺乏有效根治性治療方法，主要強調(diào)對患兒的多學(xué)科綜合管理和長期隨訪[33-34]?；驒z測可確定致病基因和遺傳方式，對確診的先證者家庭提供精準(zhǔn)遺傳咨詢并進行產(chǎn)前診斷，對優(yōu)生優(yōu)育有重要指導(dǎo)意義。