長鏈非編碼RNA單核苷酸多態性與喉鱗狀細胞癌患者的生存相關性研究

杜忠禮，房忠菊，劉業海，朱玉華，陳立偉，孔欣茹，范俊達，任 楠，徐 偉，劉明波

1北京醫院 國家老年醫學中心，國家衛生健康委臨床檢驗中心，中國醫學科學院老年醫學研究院，北京100730；2濰坊醫學院 研究生院耳鼻咽喉教研室，山東濰坊 261053；3安徽醫科大學第一附屬醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，安徽合肥 230022；4解放軍總醫院第一醫學中心 耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100853；5解放軍總醫院海南醫院 耳鼻喉頭頸外科，海南三亞 572013；6山東大學附屬省耳鼻喉醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，山東濟南 250021

手術、放療和化療是喉鱗狀細胞癌臨床治療的標準方案，并且有一定的療效，但中晚期喉癌患者預后仍然較差，研究顯示晚期喉鱗狀細胞癌患者5年生存率約為60%[1]。國內外學者正在積極探索晚期癌癥患者治療的靶基因或下游信號通路突變基因，如表皮生長因子受體、NOTCH2通路[2-4]。生物標志物對腫瘤治療和預后具有重要意義，但目前仍然沒有喉鱗狀細胞癌的敏感生物標志物。LncRNA是由人類70% ～ 90%基因組編碼的一種長度超過200個核苷酸的RNA分子[5]。LncRNA參與許多生物學過程，包括細胞代謝、免疫應答、染色質修飾、轉錄因子調控、mRNA加工和降解以及細胞信號轉導等多種調控[6-7]。LncRNA的異常表達對結直腸癌[8]、多發性骨髓瘤[9]、肝癌[10]患者的生存均有顯著影響。研究顯示lncRNA與喉鱗狀細胞癌患者的生存密切相關[11]。本課題組前期已對中國人群喉鱗狀細胞癌患者進行全基因組關聯研究，發現了3個遺傳易感基因位點[12]。本研究繼續對前期研究中的喉鱗狀細胞癌患者進行生存隨訪，并在獨立樣本中驗證，以鑒定出與喉鱗狀細胞癌患者預后相關的lncRNA基因的多態位點。

資料和方法

1 資料 本研究分為兩個階段，為全基因組關聯分析階段和驗證階段，共635例患者。第一階段為關聯分析階段，研究對象為2000年1月- 2012年12月在中國醫學科學院腫瘤醫院就診的喉鱗狀細胞癌易感性全基因組關聯研究的98例患者[12]；第二階段是驗證階段，研究對象為2009年1月-2018年3月在解放軍總醫院、安徽醫科大學第一附屬醫院和山東大學附屬耳鼻喉醫院就診的537例喉鱗狀細胞癌患者。入組標準：1)民族為漢族；2)接受全喉切除術或喉部分切除術；3)經病理組織學確診；4)隨訪生存資料完整。排除標準：1)既往有其他癌癥病史或術前有抗癌治療；2)術后不到1個月死亡；3)SNP分型信息缺失。收集患者的年齡、性別、吸煙、飲酒和腫瘤分期等臨床資料。本研究獲得解放軍總醫院倫理委員會批準(批件號：301HNFY倫審第16號)。

2 SNP篩選與分型 術前每例患者抽取3 ml外周靜脈血，采用酚-氯仿法提取基因組DNA，用于多態位點的基因分型。全基因組關聯分析階段的SNP篩選：芯片SNP分型數據經過質控后有15 231個SNP位于lncRNA基因區域[12]，初步選取生存關聯分析后與喉癌患者總生存顯著相關的717個SNP(P值范圍為1.08×10-4～ 0.005)。驗證階段的標簽SNP篩選：對全基因組關聯分析階段初步選取的717個標簽SNP進行再次篩選，篩選步驟如下：1)篩選次要等位基因頻率≥0.05的SNP；2)采用單體型域的方法進行連鎖不平衡分析，樣本量大小的膨脹因子r2＞0.8，選擇每個單體型域中P值最小的SNP。最終篩選出57個SNP在驗證階段進行驗證。SNP分型：1)全基因組關聯分析階段的樣本基因分型采用Affymetrix GeneChip Human Mapping 6.0芯片分型數據；2)驗證階段的樣本基因分型采用Sequenom MassARRAY基因分型平臺。

3 生存隨訪及分析 生存相關的全基因組關聯分析是團隊前期對喉鱗狀細胞癌全基因組關聯研究的延伸。首先由訓練有素的研究人員通過醫療記錄和電話信函方式獲得隨訪信息，隨訪的內容包括患者的生存狀態、死亡時間及死亡原因等。隨訪截止時間為2018年3月24日，635例患者獲得完整生存隨訪數據。患者的總生存時間為手術日期至死亡日期或末次隨訪日期。隨訪截止時存活患者的生存數據為截尾數據。比較攜帶不同SNP基因型患者總生存的差異，運用顯性模型、隱性模型和加性模型分別探討SNP與總生存的關系。

表1 喉鱗狀細胞癌患者的臨床特征和生存情況Tab. 1 Clinical characteristics and survival of LSCC patients (n)

4 統計學方法 采用SPSS18.0版軟件(SPSS，Chicago，IL)進行統計分析。采用χ2檢驗分析SNP的Hardy-Weinberg平衡。繪制Kaplan-Meier生存曲線并進行log-rank檢驗。通過多因素Cox回歸比例風險模型計算死亡風險比(HR)及其95%CI。Haploview軟件(v4.4)分析同一條染色體上SNP之間的連鎖不平衡。所有檢驗均為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。

結 果

1 喉鱗狀細胞癌臨床特征和生存情況 全基因組關聯分析階段的98例患者的中位隨訪時間為65個月(3 ～ 113個月)，驗證階段537例患者的中位隨訪時間為70個月(1 ～ 115個月)。全基因組關聯分析階段49例(50.0%)死亡，驗證階段165例(30.7%)死亡。635例中按照喉癌UICC分期，0期14例，Ⅰ期51例，Ⅱ期128例，Ⅲ期223例，Ⅳ期 219 例 (表 1)。

2 與喉鱗狀細胞癌患者總生存相關的基因多態位點 研究發現長鏈非編碼基因LINC00908中的rs17059513(log-rank檢驗P=0.001)、LINC01813中的rs10208830(log-rank檢驗P=0.023)和LINC01185中的rs2901182(log-rank檢驗P=0.012)均與喉鱗狀細胞癌患者總生存顯著相關。校正年齡和腫瘤分期后，攜帶rs17059513 AG基因型患者的死亡風險顯著高于攜帶rs17059513 AA基因型患者，多因素Cox回歸結果顯示HR(95%CI)為2.23(1.46 ～3.39)；攜帶rs290118CT基因型患者的死亡風險顯著高于攜帶rs290118CC基因型患者，多因素Cox回歸結果顯示HR(95%CI)為2.10(1.11 ～ 4.00)；攜帶rs10208830 CC基因型患者的死亡風險顯著低于攜帶rs10208830 GG基因型患者，多因素Cox回歸結果顯示HR(95%CI)為 0.75(0.61 ～ 0.92)。校正年齡和腫瘤分期后，多因素Cox回歸加性模型分析顯示rs17059513和rs10208830的HR(95%CI)分別為 1.95(1.34 ～ 2.83)和 0.77(0.63 ～ 0.93)；顯性模型分析顯示rs17059513和rs10208830均與患者總生存顯著相關(log-rank檢驗P值分別為1.81×10-4和0.037)(圖1A，圖1B)，多因素Cox回歸結果顯示HR(95%CI)分別為 2.19(1.45 ～ 3.32)和 0.74(0.56 ～0.98)。隱性模型分析顯示rs10208830與患者總生存顯著相關(log-rank檢驗P=0.015)(圖1C)，多因素Cox回歸結果顯示HR(95%CI)為1.59(1.10 ～2.30)。見表 2。

表2 三個基因位點與喉鱗狀細胞癌患者總生存的關聯分析Tab. 2 Associations of three loci with overall survival of LSCC patients

圖1 基于顯性模型分析rs17059513 (A)和rs10208830 (B)與喉鱗狀細胞癌患者總生存的相關性，基于隱性模型分析rs10208830 (C)與喉鱗狀細胞癌患者總生存的相關性Fig. 1 Associations of rs17059513 (A) and rs10208830 (B) with the overall survival of LSCC patients using dominant model, and association of rs10208830 (C) with the overall survival of LSCC patients using recessive model

圖2 風險等位基因 (A, B)和風險基因型(C, D)與喉鱗狀細胞癌患者總生存的相關性rs17059513 AG或GG基因型、rs10208830 GC或GG基因型和rs2901182 CT基因型是風險基因型。風險基因型數為3個位點的風險基因型數之和。rs17059513 G等位基因、rs10208830 G等位基因和rs2901182 T等位基因是風險等位基因。rs17059513 AG基因型、rs10208830 GC基因型和rs2901182 CT基因型均含有1個風險等位基因；rs17059513 GG基因型和rs10208830 GG基因型均含有2個風險等位基因。風險等位基因數為3個位點的風險等位基因數之和Fig. 2 Associations of risk alleles (A, B) and risk genotypes (C, D) with the overall survival of LSCC patients. The rs17059513 AG or GG genotype, the rs10208830 GC or GG genotype, and the rs2901182 CT genotype were considered as risk genotypes. The number of risk genotype was the sum of the risk genotypes in these three loci. The rs17059513 G allele, the rs10208830 G allele, and the rs2901182 T allele were considered as risk alleles. The rs17059513 AG genotype, the rs10208830 GC genotype, and the rs2901182 CT genotype contained one risk allele; while the rs17059513 GG genotype and the rs10208830 GG genotype contained two risk alleles. The number of risk alleles was the sum of risk alleles in these three loci

3 總生存相關的基因多態位點的累積分析 進一步對3個SNP進行累積分析，結果顯示隨著風險等位基因(圖2A，圖2B)或風險基因型(圖2C，圖2D)的增加，死亡風險比增加。攜帶3個風險等位基因的患者死亡風險最高，HR為3.11(P=2.00×10-4)(圖2B)。攜帶2 ～ 3個風險基因型的患者死亡風險最高，HR為3.24(P=3.80×10-6)(圖2D)。

討 論

LncRNA最初被認為是基因轉錄的“噪音”，但近年來研究發現其是癌癥發生和發展的重要調節因子，廣泛參與腫瘤染色體的沉默、基因組印記、染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾等多種重要的調控過程，恰似一樞紐電路板以特有的內在方式連接諸分子單元，并調控其“邏輯運算”，調控靶基因的表達[13-16]。喉鱗狀細胞癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，lncRNA在喉癌中的異常表達可作為喉癌早期診斷及生存預后的標志，以往的研究已經報道一些喉癌的生物標志物，如泛素交叉反應蛋白(UCRP)[17]、尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA)[18]、同源盒基因轉錄反義RNA(HOTAIR)[19]等。我們前期通過全基因組關聯研究確定了中國人群喉鱗狀細胞癌的遺傳易感基因位點，相關文章發表在Nature genetics[12]。本研究發現，LINC00908基因的rs17059513、LINC01813基因的rs10208830和LINC01185基因的rs2901182與喉鱗狀細胞癌患者的總生存具有顯著相關性。

本研究是第一個關注喉鱗狀細胞癌患者生存與lncRNA基因的多態位點相關性的研究。位于18q23號染色體的LINC00908基因內含子區的rs17059513顯示出最顯著的差異。有研究顯示LINC00908可作為膠質瘤潛在的預后標志物[20]，但關于LINC00908功能的報道卻很少。已有研究顯示腫瘤代謝可以由lncRNA外顯子的兩個不同的等位基因進行特異性調節[21]。而本研究中發現的rs17059513的不同等位基因也可能通過某種未知的機制影響LINC00908的表達從而影響預后，所以需要進一步的研究來闡明該位點的功能。

rs10208830和rs2901182分別位于染色體2p16.1的LINC01813和LINC01185基因內含子區。有研究顯示LINC01185所在的染色體2 p16.1區域與銀屑病相關[22]。但迄今為止，對LINC01813和LINC01185功能的研究較少。本研究確定的3個位點對喉鱗狀細胞癌預后具有累積效應。攜帶多個風險基因型或風險等位基因的患者較攜帶單個變異的患者有更差的預后。該結果提示發現與預后相關的基因位點，可借助其區分不同的預后人群，此可能成為預測喉鱗狀細胞癌患者生存預后的潛在生物標志物。