PD-1/PD-L1在Bowen病及皮膚鱗狀細胞癌中的表達研究

芝 佳，李東寧，鄭 松，楊 陽，趙鳳梅

1錦州醫科大學附屬第一醫院 皮膚科，遼寧錦州 121001；2中國醫科大學附屬第一醫院 皮膚科，遼寧沈陽 110001；3遼寧省健康產業集團撫礦總醫院 皮膚科，遼寧撫順 113008

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC)是僅次于基底細胞癌(basal cell carcinoma，BCC)的第二常見的非黑色素皮膚腫瘤，轉移率和死亡率均較高[1]，而Bowen病是一種表皮內的cSCC，約有5%患者的皮損可能發生侵襲性生長[2]。既往cSCC的治療方法大多選用Mohs顯微外科手術或標準手術切除，也可以應用放療、化療及進一步淋巴結切除手術。雖然手術切除是治療的黃金標準，但廣泛的局部破壞性或轉移性病灶仍然是治療的難題[3]。近年來，隨著人們對腫瘤的發生、發展及腫瘤的免疫逃逸機制等方面研究的不斷深入，腫瘤免疫療法已有望成為腫瘤治療領域的新方法，應用單克隆抗體阻斷程序性死亡受體-1(programmed death-1，PD-1)/程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1，PD-L1)就是其中最有效的方法之一。目前，國內外關于PD-1和PD-L1在惡性黑色素瘤、肺癌、胃癌及頭頸部鱗癌等多種惡性腫瘤中的表達以及其拮抗劑的臨床應用的相關報道很多，而關于cSCC的研究甚少，國內暫無相關報道。因此，本研究通過免疫組織化學方法觀察PD-1和PD-L1在Bowen病及cSCC中表達，并分析其與腫瘤分化程度、浸潤深度及其他臨床病理特征的關系，進一步明確PD-1和PD-L1作為cSCC進展和預后的靶標分子，為免疫治療cSCC提供理論依據。

材料和方法

1 研究對象 收集錦州醫科大學附屬第一醫院、中國醫科大學附屬第一醫院及遼寧省健康產業集團撫礦總醫院于2016年6月- 2018年5月存檔的病理診斷明確的患者皮膚活檢標本蠟塊。為防止日光及HPV病毒等因素的干擾，全部活檢標本來自遮光部位及生殖器以外部位，且患者采集標本前均未經過放療或化療等治療。通過篩選，共有49例Bowen病，47例高分化cSCC(Ⅰ級和Ⅱ級)及25例低分化cSCC(Ⅲ級和Ⅳ級)符合標準。cSCC分級參照Borders分級法：Ⅰ級，未分化細胞數＜25%；Ⅱ級，未分化細胞數25% ～ 50%；Ⅲ級，未分化細胞數50% ～ 75%；Ⅳ級，未分化細胞數≥75%。

2 實驗分組 1)分為Bowen病組、高分化cSCC組和低分化cSCC組。2)為研究PD-1和PD-L1的表達與腫瘤浸潤深度的關系，我們又將全部cSCC標本以小汗腺為界限(小汗腺位于真皮深層和皮下組織，由于所取標本部位不同及個體間差異，我們認為用相對固定的參考物衡量要比單純用侵襲深度衡量更合適)進一步分為2組，即浸潤深度未超越小汗腺水平(淺表cSCC)和浸潤深度超越小汗腺水平(深部cSCC)。見表1。

3 主要實驗試劑 兔抗人PD-1單克隆抗體(Abcam，ab137132)，兔抗人PD-L1單克隆抗體(Abcam，ab205921)，即用型S-P免疫組化試劑盒(福建邁新生物技術有限公司)，DAB試劑盒(北京中杉金橋公司)、蘇木素(北京中杉金橋公司)、檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)(北京中杉金橋公司)。

4 樣品采集及處理方法 切取4μm厚石蠟組織切片，貼于載玻片上，高溫脫蠟后用0.01 mol/L檸檬酸修復液進行抗原修復，滴加氧化酶阻斷溶液及血清封閉，室溫孵育10 min。分別滴加PD-1抗體(1∶100稀釋)及PD-L1抗體(1∶200稀釋)，4℃濕盒過夜，次日室溫復溫1 h，復溫后滴加生物素標記的二抗，室溫孵育10 min，滴加鏈霉素抗生物素-過氧化酶溶液，室溫下孵育10 min，DAB顯色，蘇木素復染，自來水沖洗，烤干，透明脫蠟，中性樹膠封片。

5 實驗判斷標準 PD-1和PD-L1陽性染色定位于細胞膜。將染色后的切片置于顯微鏡下觀察，在20倍物鏡下隨機選取5個視野，利用Image-pro Plus軟件分析平均光密度值。

6 統計學處理 采用GraphPad Prism軟件對資料進行統計學分析。計量資料以表示，組間平均光密度值比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PD-1在Bowen病、高分化cSCC及低分化cSCC中的表達 三組病人年齡、性別分布差異無統計學意義，見表1。PD-1表達于腫瘤浸潤細胞而非腫瘤細胞。Bowen病組、高分化cSCC組與低分化cSCC組的平均光密度值分別為0.005 3±0.005 9、0.016 9±0.015 3、0.036 4±0.028 3。通過統計學分析發現PD-1在低分化cSCC組表達高于高分化cSCC組(t=-3.801，P＜0.001)，在高分化cSCC組表達高于Bowen病組(t=-4.941，P＜0.01)。見圖1。

表1 患者分組情況及一般資料Tab. 1 General information of patients by grouping

2 PD-L1在Bowen病、高分化cSCC及低分化cSCC中的表達 PD-L1表達于腫瘤浸潤細胞而非腫瘤細胞。Bowen病組、高分化cSCC組與低分化cSCC組的平均光密度值分別為0.002 9±0.003 4、0.010 0±0.009 4、0.038 8±0.0035 1。通過統計學分析發現，PD-L1在低分化cSCC組中表達高于高分化cSCC組(t=-5.294，P＜0.001)，在高分化cSCC組表達高于Bowen病組(t=-4.992，P＜0.001)。見圖2。

3 腫瘤浸潤深度不同的兩組標本PD-1和PD-L1的表達情況 不同浸潤深度的兩組間比較差異無統計學意義，見表1。PD-1在淺表cSCC組和深部cSCC組的平均光密度值分別為0.020 0±0.017 5、0.026 8± 0.025 9；PD-L1在淺表cSCC組和深部cSCC組的平均光密度值分別為0.010 2±0.011 0、0.028 3±0.031 4。通過統計學分析發現PD-1和PD-L1在深部cSCC組標本表達均高于淺表cSCC組標本，PD-L1差異有統計學意義(t=-3.141，P＜0.01)，但PD-1差異無統計學意義(t=-1.326，P＞0.05)。見圖 3。

圖1 PD-1在Bowen病 (A)、高分化cSCC (B) 及低分化cSCC (C)中的表達(200×)及比較 (aP＜0.01， bP＜0.001)Fig. 1 Expression of PD-1 in Bowen's disease (A), highly differentiated cSCC (B) and poorly differentiated cSCC(C) (200×), and intergroup comparison (aP＜0.01, bP＜0.001)

圖2 PD-L1在Bowen病 (A)、高分化cSCC (B) 及低分化cSCC(C) 標本中的表達(200×)及比較 (bP＜0.001)Fig. 2 Expression of PD-L1 in Bowen's disease (A), highly differentiated cSCC (B) and poorly differentiated cSCC(C) (200×), and intergroup comparison (bP＜0.001)

表2 B ow en 病與cS CC 組織PD1 a -1/P D-L1ic op 表達與患臨床理數的關系ow Ta b. 2 R elationship b etween expression of P D-1/PD -L nd clin atholo 者gical p 病aram 參eters in B en 's d isease a nd cS CC Characteristics Bowen's disease cSCC n PD -1 expression t P PD -L 1 expression t P n PD -1 expression t PD -L 1 expression t Gender 0.657 0.515-0.231 0.819-1.521 P0.133-1.572 P0.120 Male 36 0.00 5 0±0.006 2 0.002 7±0.0 01 41 0.020 2±0.017 1 0.01 5 0±0.0 17 Female 13 0.00 6 2±0.005 0 0.002 9±0.0 03 98 31 0.028 3±0.027 9 0.02 4 5±0.0 33 92 Age 0.504 0.617-1.515 0.136 0.791 0.432-1.557 0.124＜65 yrs 23 0.00 4 9±0.007 1 0.003 6±0.0 03 28 0.021 0±0.020 2 0.02 5 0±0.0 34≥65 yrs 26 0.00 5 7±0.004 6 0.002 2±0.0 02 89 44 0.025 4±0.024 0 0.01 5 3±0.0 17 58 Race 1.099 0.277-0.212 0.833-1.289 0.221 0.822 0.425 Han 41 0.00 5 7±0.006 7 0.002 8±0.0 03 61 0.021 1±0.020 0 0.02 0 3±0.0 26 Minority 8 0.00 3 2±0.001 7 0.003 1±0.0 04 30 11 0.031 3±0.024 8 0.01 3 4±0.0 25 41 Location 0.898 0.374-0.146 0.885-1.600 0.117 0.407 0.962 Trun k 37 0.00 5 7±0.006 6 0.002 8±0.0 03 3 43 0.019 2±0.017 0 0.01 9 3±0.0 25 1 Limbs 12 0.00 4 0±0.002 4 0.003 0±0.0 03 7 29 0.027 8±0.025 2 0.01 9 0±0.0 28 1 Disease course-1.479 0.146-1.400 0.168-1.498 0.139-1.530 0.130＜5 yrs 29 0.00 6 3±0.006 9 0.003 1±0.0 03 3 45 0.026 7±0.025 2 0.02 2 7±0.0 29 9≥5 yrs 20 0.00 3 9±0.003 7 0.002 0±0.0 01 7 27 0.018 6±0.016 5 0.01 3 1±0.0 15 9 Tumor size-1.255 0.216-1.892 0.065 0.644 0.522 0.097 0.923＜2 cm 19 0.00 4 0±0.004 0 0.001 8±0.0 01 3 30 0.021 6±0.017 5 0.01 8 7±0.0 23 3≥2 cm 30 0.00 6 1±0.006 7 0.003 6±0.0 04 0 42 0.025 1±0.025 7 0.01 9 3±0.0 27 8 Tumor invasion-1.326 0.189-3.141 0.002 Superficial 39 0.020 0±0.017 5 0.01 0 2±0.0 11 0 Deeper 33 0.026 8±0.025 9 0.02 8 3±0.0 31 4 Differentiation-3.801＜0.001-5.294＜0.001 Highly 47 0.016 9±0.015 3 0.01 0 0±0.0 09 Poorly 25 0.036 4±0.028 3 0.03 8 8±0.0 03 45 Metastasis----No 72 0.023 7±0.025 9 0.01 9 1±0.0 25 9 Yes 0--

4 Bowen病及cSCC組織PD-1和PD-L1表達與患者臨床病理參數的關系 Bowen病組織PD-1和PD-L1表達與患者性別、年齡、種族、腫瘤部位、病程和腫瘤直徑無關(P均＞0.05)。cSCC組織PD-1和PD-L1表達與患者性別、年齡、種族、腫瘤部位、病程和腫瘤直徑無關(P均＞0.05)，與腫瘤的分化程度有關(P＜0.001)；PD-L1表達與腫瘤的浸潤深度有關(P＜0.01)。見表2。

圖3 PD-1和PD-L1在淺表cSCC和深部cSCC標本的表達(n.s.，無統計學差異； aP＜0.01)Fig. 3 Expression of PD-1 and PD-L1 in superficial cSCC and deeper cSCC (n.s., not signi fi cant; aP＜0.01)

討 論

已有研究證實，PD-1和PD-L1表達于多種惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、肺癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、頭頸部鱗癌、Merkel細胞癌以及淋巴瘤等[4-15]。在非小細胞肺癌及頭頸部鱗狀細胞癌中，PD-L1的表達與腫瘤的分化程度有關，而PD-L1的高表達與預后不良有關[7-8]。在肺腺癌腫瘤細胞中，PD-L1的表達與某些癌基因的組織學形態、等級和表達有關[9]。組織學上，PD-L1的腫瘤表達通常只出現在免疫反應活躍的區域[10]。在cSCC中，Slater和Googe[16]研究發現，PD-L1在20例低風險腫瘤中，有4例陽性表達(20%)；而在20例高風險腫瘤中(直徑≥2 cm，組織學評分≥2，和/或腫瘤厚度≥4 mm)，PD-L1有14例陽性表達(70%)；在5個轉移鱗癌中，PD-L1全部陽性表達(100%)，因此認為無論在低風險或高風險cSCC中，都可顯示PD-L1的表達，并且PD-L1的表達程度與腫瘤的分化程度呈負相關，與轉移風險呈正相關。

腫瘤浸潤細胞是指腫瘤微環境中的細胞成分，包括腫瘤浸潤淋巴細胞、腫瘤相關巨噬細胞、腫瘤浸潤樹突狀細胞、腫瘤相關成纖維細胞等。在腎癌組織中，PD-1在腫瘤浸潤細胞表面的高表達介導了腫瘤的免疫逃逸及患者的不良預后[11]。另有研究發現PD-1在惡性黑色素瘤患者的外周血和腫瘤組織中的腫瘤浸潤細胞表面呈高表達，引起效應性T淋巴細胞的耗竭和功能障礙，并拮抗腫瘤免疫反應[12]。乳腺癌中PD-1在腫瘤浸潤細胞的大量表達與患者生存時間較短相關[13]。在宮頸癌和肝癌中，有近半數的腫瘤浸潤CD8+T細胞表達PD-1，其與腫瘤細胞表達的PD-L1結合后，可能導致細胞毒性T淋巴細胞的耗盡及凋亡[14-15]。但目前關于PD-1在cSCC中的表達方式罕有報道。

我們的研究中，PD-1和PD-L1在Bowen病、高分化cSCC及低分化cSCC腫瘤浸潤細胞中均有不同程度的表達，通過統計學分析發現PD-1和PD-L1在低分化cSCC表達最高，其次是高分化cSCC，再次是Bowen病，在深部cSCC表達高于淺表cSCC組，結論與Slater和Googe[16]的研究結果基本一致。PD-1和PD-L1在有侵襲性的cSCC中高表達，為PD-1/PD-L1抑制劑的腫瘤免疫治療奠定了基礎。PD-1在深部cSCC組標本表達高于淺表cSCC組標本，雖然無統計學差異，但這也可能與統計樣本量不足有關，具體原因還有待于進一步觀察證實。

PD-1/PD-L1抑制劑是針對PD-1/PD-L1通路的抗體蛋白，可以此為靶點賦予免疫細胞更強的殺傷活性，實現腫瘤的精準治療。近年來，抗PD-1/PD-L1藥物治療研究在多種惡性腫瘤中開展，目前通過美國FDA認證的PD-1抑制劑的藥物有納武單抗(Nivolumab)和帕姆單抗(Pembrolizumab)，PD-L1抑制劑有阿特珠單抗(Atezolizumab)[17]，另外還有多種藥物正在進行臨床試驗中，暫未上市。并且Nivolumab也于2018年6月15日獲國家藥品監督局批準國內上市。隨著腫瘤免疫逃逸機制研究的深入，以及多項臨床試驗的開展，人們發現運用單克隆抗體阻斷PD-1/PD-L1信號通路已成為一種新的腫瘤免疫治療手段，其在惡性黑色素瘤、肺癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、頭頸部鱗癌以及淋巴瘤等多種類型腫瘤的治療過程中均表現出顯著療效[18-20]。Degache等[21]報道了2例Pembrolizumab治療的巨大性難治性cSCC病例，均獲得了比較好的療效，而且沒有出現明顯的毒性作用。其中1例左側頸椎區的9 cm×8 cm大小的腫瘤，給予Pembrolizumab單抗2 mg/kg，每3周注射一次，3次注射后證實腫瘤減到2 cm×2.5 cm。PD-1/PD-L1抑制劑的藥物臨床研究已獲得階段性成果，并從單藥研究深入到聯合用藥研究，根據腫瘤微環境的免疫狀態不同，其效果也存在差異。在耐藥機制、腫瘤標志物檢測等方面的研究也在逐漸完善。

綜上所述，本研究發現PD-1和PD-L1在Bowen病及cSCC中差異表達，并且與腫瘤分化程度和浸潤深度相關，這為PD-1/PD-L1單克隆抗體用于治療Bowen病及cSCC提供了理論依據。PD-1/PD-L1有望成為cSCC預后的生物標志物及免疫藥物治療的靶點。