Nedl1基因敲除鼠匹魯卡品癲癇模型的建立

盧 倩，劉夢佳，張令強，鄒麗萍,

1首都醫科大學腦重大疾病研究中心，北京腦重大疾病研究院，北京 100069；2解放軍總醫院第一醫學中心 兒內科，北京 100853；3軍事科學院軍事醫學研究院生命組學研究所，蛋白質組學國家重點實驗室，北京 100850

癲癇是一種常見的神經系統疾病，主要表現為神經元異常放電、反復癇性發作，全世界約7 000萬的癲癇患者，雖然抗癲癇藥物不斷發展，但仍然有近1/3的患者發作難以控制[1]。癲癇病因復雜，主要包括結構、基因、感染、代謝、免疫和未知原因等[2]。反復的癲癇發作不僅對患者造成嚴重的傷害，還給其家庭和社會帶來負擔，因此對于癲癇發病機制的研究顯得尤為重要。細胞內的蛋白翻譯后的修飾過程稱為蛋白泛素化，主要由泛素蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system，UPS)介導。UPS由泛素分子 (ubiquitin，Ub)、泛素激活酶(Ub-activating enzyme，E1)、泛素結合酶(Ub-conjugating enzymes，E2)、泛素連接酶(Ub ligases，E3)、去泛素化酶 (deubiquitinases，DUBs)等構成[3]。UPS參與多種生命過程，如細胞周期的調控和發育、翻譯調節、DNA修復、信號轉導和蛋白的降解等[4]。泛素化過程異常可以引起多種疾病，最近有文獻報道蛋白泛素化異常導致癲癇，如UBE3A(ubiquitin-protein ligase E3a)是一種E3，功能缺失可導致Angelman綜合征[5]；Malin是由EPM2B編碼的E3，Malin功能異常可導致Lafora疾病[6]；NEDD4-2(neuronal precursor cell expressed developmentally downregulated 4-2)調節細胞內吞及離子通道的溶酶體降解，與神經元興奮性及癲癇有關[7]；NEDL2(NEDD4-like ubiquitin protein ligase-2)突變與神經發育落后、癲癇相關[8]。NEDL1又稱為HECW1，是含有HECT結構域的E3。NEDL1在腦中特異性高表達，其次是腎，其氨基酸序列在鼠與人中相似度達到78%[9]。文獻報道NEDL1與腫瘤及家族性肌萎縮側索硬化相關[9-10]。目前尚無NEDL1與神經系統疾病相關的報道，我們通過建立Nedl1基因敲除鼠匹魯卡品癲癇模型，研究NEDL1與癲癇的關系。

對象與方法

1 實驗動物 選擇C57BL/6小鼠通過Cre-Loxp系統構建Nedl1-/-小鼠。第一只Nedl1-/-小鼠來自軍事科學院軍事醫學研究院生命組學研究所，我們將Nedl1-/-小鼠和Nedl1+/+小鼠進行合籠，產下F1代為雜合型小鼠，再將雜合型小鼠雜交，得到Nedl1-/-小鼠，我們通過對小鼠尾部提取的DNA進行PCT鑒定基因型[11]。小鼠于SPF級動物房飼養，濕度40% ～ 70%，室溫20℃～ 25℃。所用的墊料、飼料、飲水均經過高壓滅菌處理，實行自由飲食、飲水，墊料每周更換兩次。選擇8周齡的Nedl1+/+小鼠和Nedl1-/-小鼠進行試驗。

2 匹魯卡品癲癇模型的制作 選取8周的Nedl1+/+小鼠和Nedl1-/-小鼠。腹腔注射給藥，首先給予2 mg/kg的甲基東莨菪堿(美國Sigma-Aldrich)、硫酸特布他林，主要用于拮抗匹魯卡品導致的周圍膽堿能受體的興奮作用。30 min后腹腔注射鹽酸匹魯卡品(美國Sigma-Aldrich)，劑量為245 mg/kg(經過前期預實驗得出藥物劑量)。視頻記錄并觀察小鼠的表現。癲癇的發作嚴重程度等級是按照Racine量表進行分級評估的。Racine[12]癲癇分級標準：1級，面部肌肉抽搐，有眨眼、動須、節律性咀嚼等動作；2級，出現點頭的動作；3級，一側前肢出現陣攣；4級，雙側前肢出現陣攣；5級，失去平衡摔倒。2 h后給予10%水合氯醛控制癲癇發作，劑量為2 ml/kg。選擇2 h內發作達3級以上并且發作次數在3次以上，即達到癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)[13]的小鼠進行下面實驗。

3 組織染色 小鼠麻醉后斷頭取出腦組織冠狀切面，常規Nissl染色，光學顯微鏡下細胞計數及細胞形態觀察。將腦組織用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋。將5μm后切片脫石蠟，血清封閉，加入一抗NPY(Abcam，1∶100)，加入熒光二抗(熒光標記羊抗兔IgG為1∶100)，加入DAPI溶液避光孵育，封片。

4 統計分析 使用SPSS20.0進行統計學分析。計量資料符合正態分布，以表示，兩樣本均數的比較，采用t檢驗；不符合正態分布，使用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。使用Image Pro Plus 6.0分析NPY免疫熒光染色，使用GraphPad Prism 6進行圖表制作。

結 果

1 匹魯卡品癲癇模型制作 選擇Nedl1+/+小鼠(28只)和Nedl1-/-小鼠(17只)進行匹魯卡品癲癇模型制作，腹腔給藥后幾分鐘，小鼠出現活動減少，尾巴伸直、點頭、腹部貼地爬行、全身抖動，偶爾出現陣攣發作。通過對不同基因型的小鼠癲癇模型后2 h發作情況進行統計。癲癇發作等級：Nedl1-/-小鼠癲癇發作等級顯著低于Nedl1+/+小鼠(3.40±0.36 vs 3.90±0.16)(P=0.000)；2 h內 3級及以上癲癇發作的次數：Nedl1-/-小鼠癲癇發作次數顯著少于Nedl1+/+小鼠(13.05±7.84 vs 20.00±8.47)(P=0.004)；首次出現3級以上發作的時間：Nedl1-/-小鼠所用時間明顯長于Nedl1+/+小鼠(42.23±15.48 vs 24.4±17.06)(P=0.016)，差異均有統計學意義。癲癇模型后Nedl1-/-小鼠全部存活，而Nedl1+/+小鼠死亡13只(46.4%)(圖1)。

圖1 視頻統計不同基因型小鼠癲癇發作嚴重程度[Nedl1-/-組n=17； Nedl1+/+組n=15 (A、B、C)， Nedl1+/+組n=28 (D). aP＜0.05]A：Racine等級； B：2 h內3級及3級以上發作的次數； C：首次出現3級及以上癲癇發作的時間； D：死亡情況Fig. 1 Video statistics of the severity of seizures in mice (n[Nedl1-/-]=17; A-C: n[Nedl1+/+]=15; D: n[Nedl1+/+]=28. aP＜0.05)A: the grading of seizures using Racine scale; B: the number of seizures at stage 3-5 (Racine scores) in 2 hours; C: the time interval of status epilepticus (SE); D: mortality rate of epileptic model

圖2 癲癇模型建模后1個月Nedl1+/+小鼠和Nedl1-/-小鼠海馬Nissl染色結果(n=3)A ～ D： Nedl1+/+未造模組； E ～ H： Nedl1-/-未造模組； I ～ L： Nedl1+/+癲癇模型后1個月； M ～ P： Nedl1-/-癲癇模型后1個月； Q： 癲癇模型后1個月兩組海馬各個區域細胞計數； R ～ S： 未造模和癲癇模型后1個月在海馬CA1、 DG區細胞計數Fig. 2 Nissl staining results in hippocampus of Nedl1+/+ mice and Nedl1-/- mice at 1 month after establishing the epileptic model (n=3)A-D: Unmodeled Nedl1+/+ mice; E-H: Unmodeled Nedl1-/- mice; I-L: Nedl1+/+ mice 1 month after the epileptic model; M-P: Nedl1-/- mice 1 month after establishing the epileptic model; Q: cell counts of the hippocampus in the two groups 1 month after the epilepsy model;R-S: cell counts in CA1, DG area of hippocampus between unmodeled and epilepsy model; aP＜0.05

2 癲癇模型后小鼠腦組織Nissl染色比較 選擇未造模及癲癇模型后1個月的Nedl1+/+小鼠和Nedl1-/-小鼠各組3只，取腦組織進行Nissl染色。癲癇模型后1個月，低倍鏡下觀察(40×)見Nedl1+/+小鼠與Nedl1-/-小鼠海馬區域整體結構無明顯差異；高倍鏡下觀察(400×)可見Nedl1+/+小鼠CA1區、CA3區和DG區細胞著色增加，細胞排列紊亂，并且DG區的細胞明顯固縮，細胞形態改變。癲癇模型后1個月，Nedl1+/+小鼠海馬CA1區細胞計數明顯低于Nedl1-/-小鼠(P=0.03)，并且較未造模時期明顯減少(P=0.01)。癲癇模型后1個月，Nedl1+/+小鼠及Nedl1-/-小鼠海馬CA3區、DG區細胞計數無明顯差異，與未造模時期相比無明顯變化(P＞0.05)(圖 2)。

3 癲癇模型后小鼠腦組織NPY免疫熒光染色比較癲癇模型后1個月Nedl1+/+小鼠與Nedl1-/-小鼠(各3只)海馬NPY(表示苔蘚纖維發芽情況)免疫熒光染色比較，CA3區雖無統計學差異(P=0.36)，但是Nedl1-/-小鼠免疫熒光明顯較Nedl1+/+小鼠弱。在DG區，Nedl1+/+小鼠免疫熒光染色較Nedl1-/-小鼠明顯增多(P=0.03)，并且在海馬上齒狀回上顆粒層出現NPY免疫熒光，Nedl1+/+小鼠苔蘚纖維發芽較Nedl1-/-小鼠明顯(圖3)。

圖3 癲癇模型后1個月海馬NPY免疫熒光染色(n=3)A、 C、 E： Nedl1+/+癲癇模型建模后1個月； B、 D、 F：Nedl1-/-癲癇模型后1月； G ～ H：兩組海馬CA3區和DG區NPY免疫熒光比較Fig. 3 NPY immuno fl uorescence staining results in hippocampus of Nedl1+/+ mice and Nedl1-/- mice at 1 month after establishing the epileptic model (n=3)A, C and E: Nedl1+/+ mice 1 month after establishing the epileptic model; B, D and F: Nedl1-/- mice 1 month after establishing the epileptic model; G-H: NPY immuno fl uorescence in the CA3 and DG of the hippocampus between Nedl1+/+ and Nedl1-/- (aP＜0.05. Arrows on the granular layer of the dentate gyrus NPY immunofluorescence indicates mossy fi ber sprouting conditions)

討 論

Nakagawara[14]在神經母細胞瘤患者的腫瘤組織中發現NEDD4 E3同源的基因KIAA0322，由于該基因編碼的蛋白有N端的C2區域、兩個WW區域和C端的HECT結構域，因此將這個新發現的基因命名為NEDL1。NEDL1在神經系統特異性高表達，目前對NEDL1研究較少，主要集中在腫瘤方面和肌萎縮側索硬化癥。我們課題組前期通過對Nedl1+/+小鼠與Nedl1-/-小鼠腦、腎、心臟、肌肉、肝、脾等組織H&E染色比較，發現兩組無明顯差異，提示NEDL1并不影響小鼠生存[11]。

本研究中應用NEDL1基因敲除小鼠，建立匹魯卡品癲癇模型，文獻中關于匹魯卡品使用的劑量沒有明確的規定，單次腹腔給藥劑量從175 mg/kg到400 mg/kg不等，小鼠未達到SE狀態或死亡率差異較大，有文獻報道175 mg/kg的藥物劑量死亡率約25%，而也有文獻報道400 mg/kg的藥物劑量未達到SE狀態或死亡率為70%[15-16]。我們經過前期的預實驗后，發現劑量過大會導致死亡率較高，因此選擇245 mg/kg的匹魯卡品藥物劑量進行試驗。我們實驗發現Nedl1+/+小鼠癲癇發作次數、發作等級及死亡率均較Nedl1-/-小鼠嚴重，并且發現癲癇模型后Nedl1+/+小鼠海馬CA1及DG區神經元改變明顯，Nedl1+/+小鼠海馬DG區苔蘚纖維發芽明顯。

NPY是由36個氨基酸組成的肽類，在哺乳動物中樞神經系統的GABA能中間神經元中廣泛表達[17-18]。NPY免疫反應性以及相對應的Y2受體在顳葉癲癇患者的海馬表達增加，在反復癲癇發作的嚙齒動物腦中表達也增加[19]。在海馬齒狀回上顆粒層的NPY表達可以反映苔蘚纖維發芽[20]。Borges等使用CF1小鼠并建立匹魯卡品癲癇模型，全部CF1小鼠在癲癇31 d時在海馬上齒狀回上顆粒層出現NPY的表達，反映苔蘚纖維發芽情況。我們的實驗中發現癲癇1個月后Nedl1+/+小鼠NPY免疫熒光較Nedl1-/-小鼠強，并且在Nedl1+/+小鼠齒狀回上顆粒層發現有NPY熒光染色，說明Nedl1+/+小鼠苔蘚纖維發芽情況較Nedl1-/-小鼠嚴重，加重癲癇的發作。

p53是具有多種功能的蛋白，其可以調節細胞周期、細胞分化、DNA修復及自噬，文獻報道p53過度表達可致海馬神經元死亡[21-22]。長期顳葉癲癇患者海馬的p53水平升高[23]。已經發現p53缺乏小鼠癲癇模型皮質及海馬神經元死亡減輕，p53抑制劑可減輕癲癇后神經元死亡[24-25]。NEDL1可增強p53的轉錄活性及促凋亡功能，在腫瘤中發揮重要作用。本研究中Nedl1基因敲除小鼠匹魯卡品模型癲癇發作及腦組織病理改變程度均較Nedl1+/+小鼠輕，可能為Nedl1基因敲除后，p53表達減低，因此癲癇發作時神經元損害減少，癲癇發作減輕。本研究為控制癲癇發作提供了新思路，將來仍需進一步實驗證明。