1,2,4-丁三醇的雙水相萃取

杜宣慧，錢方圓，陸信曜，2，3，宗紅，3，諸葛斌，3

（1 江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2 非糧生物質酶解國家重點實驗室，廣西南寧530255；3 江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，生物工程學院，工業微生物研究中心，江蘇無錫214122）

1,2,4-丁三醇（1,2,4-butanetriol, BT）是一種重要的平臺化合物，廣泛應用于醫藥、軍工、化妝品等行業[1-2]。目前工業生產BT采用化學法[3]，環境不友好、反應條件苛刻。2003 年，研究人員利用重組大腸桿菌首次實現了BT 的生物合成[1]。近年來，BT 的生物法合成技術在國內外取得了較大進展[4-5]，但有關BT分離提取的報道較少。BT是一種高沸點且高親水性化合物，傳統的分離方法如減壓蒸餾、吸附等，難以分離[6]。李敏[6]根據BT 的化學性質，通過羥醛縮合反應，建立了反應萃取-水解耦合工藝分離發酵液中的BT，最后BT的回收率為84%±5%。

雙水相萃取法是一種新型的萃取分離技術[7]，具有提取條件溫和、界面張力低、周期短、可擴大生產[8-9]等優點。此外，雙水相體系中的有機溶劑和無機鹽，價格低廉、可回收利用、經濟環保。目前雙水相萃取分離技術已廣泛應用于生物制品[10]、中藥[11]和金屬離子[12]的分離，而其萃取分離BT還未有報道。本文就雙水相萃取分離技術萃取分離BT進行研究，為發酵液中BT的分離提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

蛋白胨、酵母粉，Oxiod 公司；D-1,2,4-丁三醇標準品，阿拉丁試劑(上海)有限公司；卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

5L發酵罐BIOTECH-5BG-7000A，上海保興生物設備有限公司；高效液相色譜儀P680，美國Dionex 公司；液相色譜柱Aminex HPX-87 column，美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵液的制備

菌種來源：E.coliKXW3009，實驗室保藏，構建方法和發酵條件見文獻[13]。

種子培養基與培養條件（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10；1×105Pa 滅菌15min，接種量為1%，溫度37℃，轉速150r/min，培養時間8h。

發酵培養基與培養條件（g/L）：酵母粉7.5，蛋白胨15，NaCl 15，葡萄糖10，木糖30；1×105Pa 滅菌15min。5L 發酵罐裝液量2.5L，10%接種量，葡萄糖初始濃度為10g/L，木糖初始濃度為30g/L，溫度37℃，攪拌轉速400r/min，通氣量為2m3/min，用10mol/L NaOH 溶液控制pH 為6.5。在發酵培養12h 時一次性補加300mL 的84g/L 葡萄糖和252g/L 木糖。發酵結束后將發酵液以4000r/min 離心20min，將離心去除菌體后的上清液保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 BT在不同鹽析萃取體系中的分配情況

分別用不同的有機溶劑（甲醇、乙醇、異丙醇）、無機鹽[(NH4)2SO4，K2HPO4，NaCl]兩兩組合形成雙水相體系，考察不同雙水相體系下BT分配系數和萃取效率。操作如下：體系總質量為10g，離心去除菌體后的發酵液置于離心管中，加入無機鹽溶解后添加一定量有機溶劑，旋渦震蕩10min，靜置10h，待完全分相后，記錄上下相體積，檢測上下相中BT濃度，計算分配系數和萃取效率。

1.2.3 無水乙醇/K2HPO4雙水相相圖的繪制

采用濁點法繪制乙醇/K2HPO4相圖，考慮到BT對體系的影響，將適量BT 標品加入鹽溶液中，根據濁點法[14]繪制相圖。

1.2.4 無水乙醇、K2HPO4分數對BT 分配系數的影響

取2g K2HPO4加入到離心后的發酵液中，K2HPO4質量分數為20%，溶解后分別加入質量分數為20%～30%的無水乙醇構成不同的雙水相體系，考察不同的無水乙醇質量分數對BT 分配系數和萃取效率的影響。同樣，在體系中維持無水乙醇質量分數為28%，向體系加入不同量的K2HPO4（質量分數為20%～30%），考察不同的K2HPO4質量分數對BT分配系數和萃取效率的影響。

1.2.5 pH對BT分配系數的影響

在發酵上清液中加入質量分數為28% 的K2HPO4溶解后，用10mol/L NaOH 和5mol/L H2SO4溶液調節該溶液pH，分別調pH 為5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，再加入質量分數為28%的無水乙醇，構建雙水相體系，考察不同pH對BT分配系數和萃取效率的影響。

1.2.6 放大實驗對BT萃取效率的影響

在最佳萃取條件下[乙醇質量分數為28%、(NH4)2SO4質量分數28%，pH 9.5]，分別將雙水相體系質量從10g擴大到100g、500g，考察放大體系對BT萃取效率和分配系數的影響。

1.3 分析方法

BT測定方法見文獻[4]。分配系數（K）、BT萃取效率（E）和體積比分別按照式(1)～式(3)計算。

式中，K為分配系數；ρ1、ρ2為上下兩相中的BT的質量濃度，g/L；R為相比；Vt、Vb為上下相的體積，mL；E為BT萃取效率，%。

2 結果與討論

2.1 雙水相體系的選擇

表1 不同雙水相體系下BT的分配系數和萃取效率（有機溶劑/無機鹽質量分數20%/20%）

2.2 無水乙醇/K2HPO4雙水相相圖

相圖反映了在一個體系中水溶液兩相的形成條件及其定量關系，曲線下方是均相區，在該配比下不會得到分開的兩相，曲線上方是兩相區，在該配比下可以形成分開的兩相[19]。為了解BT 存在的情況下，無水乙醇/K2HPO4中的成相范圍，用濁度法繪制無水乙醇/ K2HPO4雙水相相圖，結果見圖1。如圖1(a)所示，無水乙醇/K2HPO4雙水相體系成相范圍廣，在K2HPO4質量分數為19.83%～46.87%均可以成相，在兩相區內，上相富含無水乙醇，下相富含K2HPO4。當K2HPO4濃度較低時，K2HPO4的鹽析效應較弱，導致其難以形成雙水相體系，隨著K2HPO4的增加，鹽析效應增強，當無水乙醇達到一定濃度既可形成雙水相體系，并且所需無水乙醇的濃度隨K2HPO4濃度的增加而減少。更多K2HPO4的加入，增加了鹽析效應，導致對水的競爭能力增強，促進分相[20]。綜合考慮無水乙醇和K2HPO4質量分數，實驗點從曲線上方的區域選取。

2.3 無水乙醇質量分數對BT萃取效率的影響

選擇質量分數為20%的K2HPO4和不同質量分數（20%～30%）的無水乙醇分別組成雙水相體系，研究BT 的分配系數和萃取效率的影響見圖1(b)。在圖1(b)中，最初BT 的萃取效率隨無水乙醇質量分數的增加而提高，當雙水相體系中K2HPO4和無水乙醇質量分數分別為20%和28%時，BT 的分配系數和萃取效率分別達到6.04 和92.82%，繼續增加無水乙醇，萃取效率降低，這與文獻[21]結論相似。無水乙醇/K2HPO4雙水相體系的分離過程是無水乙醇和K2HPO4爭奪水分子的過程，溶劑的水化能力和無機鹽的鹽析能力直接關系到萃取結果，BT 在該雙水相體系下更趨向分配于上相，而無水乙醇用量的增加，上相中水分子增加，下相中水分子減少，下相出現鹽析效應，更多的BT被“排出”下相，降低了下相中BT的濃度，提高了BT的分配系數和萃取效率，但過量的無水乙醇會與水互溶，進入下相，帶走一部分無水乙醇中的BT，上相的BT 濃度降低，分配系數和萃取效率減小，這也是當無水乙醇質量分數達到30%時，BT 分配系數和萃取效率降低的原因。因此后續實驗都采用質量分數28%的無水乙醇進行研究。

圖1 無水乙醇/K2HPO4雙水相相圖及無水乙醇質量分數、K2HPO4質量分數和pH對BT萃取效率的影響

2.4 K2HPO4質量分數對BT萃取效率的影響

考察K2HPO4質量分數對BT的分配系數和萃取效率的影響，用5 組不同的K2HPO4質量分數進行一系列實驗，結果如圖1(c)所示。相比于無水乙醇質量分數對BT 的分配系數和萃取效率的影響，K2HPO4質量分數的增加對BT萃取效率的提高影響較小，從結果可知，當K2HPO4為28%時萃取效果最佳，當K2HPO4質量分數小于28%時，BT的分配系數隨K2HPO4質量分數的增加而提高，但是加入質量分數為30%的K2HPO4時，分配系數降低。因為K2HPO4質量分數的增加，會增加競爭締合水分子的能力，增強鹽析能力，導致更多的水分子進入下相，使上相中BT 的濃度增加，分配系數和萃取效率提高，但是添加過多的K2HPO4，會讓BT隨水進入下相，反而降低分配系數[22]，因此選擇K2HPO4質量分數為28%。

2.5 pH對BT萃取效率的影響

體系pH 的改變會影響兩相間的電位差，同時會導致兩相帶電性質的變化[10]。通過控制體系pH 為5.0～10.0，考察pH 對BT 萃取效率的影響，如圖1(d)所示。體系的原始pH 為9.11，在pH＜7.0 時會有大量K2HPO4析出，無法形成雙水相體系。在pH＞7.0 時，pH 對BT 的分配系數和萃取效率有較大影響，當pH 為9.5 時，BT 的萃取效率最佳，分配系數和萃取效率分別達到了18.35 和95.87%。BT 為多元醇，電位差的改變對其影響并不大，但發酵液中其他物質在不同pH 下，分離效果不同，越接近其等電點，越容易被分離出來，使得上相中BT 濃度更高，萃取效率和分配系數增加。

2.6 放大體系對BT萃取效率的影響

將原始10g雙水相體系放大至100g、500g（因500g 體系較大，震蕩方式不合適，所以換成攪拌），考察放大體系對分配系數和萃取效率的影響。從表2可知，隨著體系的放大，體系混合不充分，兩相分離效果不佳，導致雙水相體系萃取BT的分配系數和萃取效率有輕微降低，但是影響不大，說明該方法萃取分離BT 有一定的穩定性，可以放大使用。

表2 放大體系對BT萃取效果的影響

3 結論

采用雙水相體系對發酵液中的BT 進行萃取分離，篩選不同的雙水相體系，優化有機溶劑和無機鹽質量分數、pH 后，得到最佳的雙水相體系為無水乙醇/K2HPO4，最佳的萃取條件為：無水乙醇/K2HPO4質量分數比為28%/28%，pH為9.5，分配系數和萃取效率分別為18.35和95.87%。放大實驗結果表明，萃取效率和分配系數所受影響不大。采用雙水相萃取技術萃取BT的萃取效率高，條件溫和，無水乙醇易于回收，可反復利用，經濟適用，可為工業采用生物發酵法生產BT 以及其下游分離提供參考。