醬油安全檢測分析技術研究進展

李陽，耿越

(山東師范大學 生命科學學院，山東師范大學食品營養與安全重點實驗室，山東省動物抗性生物學重點實驗室，濟南 250014)

據史料記載，我國在2100多年前已經用大豆為原料制作豆醬，東漢時的“醬清”即為醬油，但在北宋時才正式有了“醬油”的稱呼[1]，公元前1世紀，醬油釀造技術傳播到了整個亞洲，目前應用廣泛，包括西餐和預制食品。

醬油是我國人民生活中必不可少的調味品，其不僅能為菜肴帶來鮮美又醇香的口感和風味，而且根據研究報道發現，醬油還具有抗氧化、降血壓和抗癌等一些生理功能[2]。我們常說的醬油一般包含釀造醬油和配制醬油，釀造醬油是采用天然發酵的方法，以大豆和/或脫脂大豆、小麥和/或小麥粉和/或麥麩為主要原料(也有人用棉籽餅釀制醬油[3])，經微生物發酵制成的具有特殊色、香、味的液體調味品；配制醬油是以釀造醬油為主體且比例不少于50%的與酸水解植物蛋白調味液、食品添加劑等配制而成的液體調味品[4]。新出臺的GB 2717-2018《食品安全國家標準 醬油》，將醬油的范圍做了修改，自2019年12月21日起，醬油僅指釀造醬油，但是該標準的理化指標僅對氨基酸態氮作了要求，無法對釀造醬油及配制醬油進行區分，極易摻假。

釀造醬油的成本遠高于配制醬油，所以不少不法商販會在釀造醬油中摻入酸水解植物蛋白液或其他添加劑來冒充釀造醬油，但研究發現有的醬油不僅不含釀造組分，甚至沒有酸水解植物蛋白液，還有許多品牌為了節約成本，會在釀造醬油中添加谷氨酸鈉來提高醬油品級[5]。醬油與人們的生活密切相關，所以人們對其安全也格外關注，已有不少研究者建立了鑒別醬油摻假的研究方法。

1 氨基酸分析法

游離態氨基酸在醬油中含量豐富，通常占醬油總含氮量的50%～75%，是衡量醬油品質好壞的重要指標之一[6]，所以很多研究者從氨基酸含量入手，尋找鑒別醬油真假的方法。

馮霞利用全自動氨基酸分析儀對市售醬油(6個月)和陳年醬油(24個月)的中式、韓式兩種類型醬油進行氨基酸含量分析，這兩種醬油都富含種類全面的氨基酸，特別是人體必需的氨基酸和鮮味氨基酸，雖然陳年醬油的總氮、氨基酸態氮等含量均略低于市售短時間發酵醬油，但二者間差異不太大。

馮志強利用全自動氨基酸分析儀對醬油中氨基酸進行了分析，確定了鑒別釀造醬油和配制醬油的氨基酸指標，但僅能區分釀造醬油，不能確定是否添加了酸水解植物蛋白調味液。后來，該實驗另一研究者周芳梅等[7]用全自動氨基酸分析儀通過對8種釀造醬油、2種配制醬油和3種植物蛋白水解液的氨基酸指紋圖譜進行分析，建立了鑒別釀造醬油摻假的模型，經實驗驗證，當釀造醬油中植物蛋白水解液添加量超過10%時，即可鑒別出來。但是該法僅對醬油中的氨基酸含量鑒定作為真假判斷，容易使不法商販抓住漏洞摻假，且儀器性價比不高，有一定的局限性，隨著高效液相技術的成熟，該法已逐漸被淘汰，所以此方法現已很少有研究者使用。

2 紅外光譜法

紅外光譜技術是一種新興的技術，因操作簡便、無需化學試劑，具有省時省力、環保、成本低等優點，且檢測精度高，在醬油檢測中有優良的發展潛力。

童曉星等[8]通過應用近紅外光譜測得透射光譜曲線，結合主成分分析和人工神經網絡建立了醬油品牌鑒別模型，結果表明，醬油品牌(8個品牌，共242個樣品)的識別率達到98.75%。說明運用近紅外光譜可以準確、快速地對醬油品牌進行鑒別。通過光譜信息分析可以得出6920，5985，5536，5481，4488.5 cm-1是醬油的敏感波段，可以進一步研究確定特征波長，進行化學分析。醬油的主要成分有總酸、氨基酸態氮和全氮，通過研究可以進一步得到這些化學成分與光譜指紋的關系，并為開發相應的鑒別儀器提供了依據。

邱丹丹等[9]首次采用傅里葉變換紅外光譜結合最小偏二乘法(PLS)，對釀造醬油、酸水解植物蛋白液(AHVP)以及添加不同比例(10%～50%)AHVP制得的配制醬油進行類別分析。結果表明，釀造醬油、酸水解植物蛋白液及配制醬油在以PLS主成分為坐標的二維線性投影圖中分布差異明顯；通過模型相關系數(R2)和交互驗證標準差(RMSECV)比較，篩選出建模光譜波段為4000～500 cm-1，同時確定了最適主因子數為8。利用模型成功對21份盲樣進行鑒定，證明利用PLS 建立的模型能有效地檢測配制醬油中HVP的添加量，且最大偏差小于3.5%。

醬油中含有16%～20%(W/V)的氯化鈉，由于與高鹽食品消費有關的健康風險，醬油中的氯化鈉含量應至少降至5%～10%(W/V)，因此Moscetti等[10]研究結合幾種過程分析技術(PAT)工具，如近紅外光譜(NIR)、電導探針和電流發生器的控制策略，開發了電滲析脫鹽(ED)建模所需的主要醬油物理化學性質(密度、滲透壓、電導率；鹽和非鹽固體濃度)的NIR模型，并將其應用于實驗，明顯降低了醬油的含鹽量，研究者還提出將該方法用于海水淡化的預想。

紅外光譜法分析速度快，可在1 min內完成檢測，環保而且對樣品無損，便于快速檢測，但是它在食品檢測方面靈敏度比較低、變動性大，易對結果造成影響；當一種基團在近紅外光譜區的多個波長處都有吸收時，譜峰易重疊，影響精度；光譜技術對檢測樣品數量的精確和樣本代表性的要求較高，研究者要具備專業的化學分析知識，遵循標準方法規定進行試驗檢測。但總體來看，紅外光譜技術的優勢大于劣勢。

3 氣相色譜法

氣相色譜法的檢測速率快、分離效率高、樣品進樣量少、靈敏度和精確度都很高，所以被廣泛應用到各個領域。氣相色譜法常與質譜法聯用，不僅增強了氣相色譜的分離能力和靈敏度，還增加了鑒別和定性的能力。

不同類型的自然釀造醬油生產工藝會導致揮發性組分出現明顯差異[11]，所以馮笑軍等[12]利用蒸餾萃取/氣相色譜-質譜(SDE/GC-MS)方法對4種不同工藝(高鹽稀態釀造醬油、低鹽固態釀造醬油、常溫半固態釀造醬油和配制醬油)生產的醬油香氣成分進行了分析，共鑒定出51種化學成分，其中3種釀造醬油中的共有成分為35種。實驗發現不同生產工藝的釀造醬油中醇類、酚類、醛酮類、酯類物質的種類均比配制醬油多1倍以上，酸類物質的總含量也遠高于配制醬油，但配制醬油的雜環類風味物質比較豐富。釀造醬油中的一些特征香氣成分如乙醇、3-甲硫基丙醇、苯乙醇、乙烯基-2-甲氧基-苯酚、4-乙基-苯酚、香草醛、2-羥基丙酸乙酯、乙酸苯甲酯、亞油酸乙酯、十六酸乙酯、5-甲基糠醇、3-苯基呋喃等在配制醬油中都未檢出，可以此來鑒別釀造醬油和配制醬油。

易青等[13]結合固相支持液液萃取凈化樣品前處理技術，建立了無需衍生化反應的在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯質譜同時測定食品中氯丙醇的方法。通過線性實驗、空白加標回收實驗等方法學實驗驗證了方法的準確性。與傳統的氣相質譜-串聯質譜衍生化方法相比，本方法簡便、快速、經濟，適用于食品中氯丙醇的檢測。依據食品安全國家標準GB 2762-2012《食品中污染物限量》，實驗中采用的20份醬油樣品中有4份氯丙醇超標。

醬油樣品基質復雜，其分析中的前處理方法尤為重要，固相萃取法是有機分析中最常用的樣品前處理方法，可有效地富集目標物及凈化干擾物，在醬油樣品分析應用中也比較常見。而頂空固相微萃取是在固相萃取技術上發展起來的一種微萃取分離技術，是一種集采樣、萃取、濃縮和進樣于一體的無溶劑樣品微萃取新技術。與固相萃取技術相比，固相微萃取操作更簡便，攜帶更方便，操作費用低廉；另外，克服了固相萃取回收率低、吸附劑孔道易堵塞等缺點。因此，已成為目前所采用的樣品前處理技術中應用最廣泛的方法之一。

肖昭競[14]采取靜態頂空固相微萃取(HS-SPME)的樣品前處理方式結合氣相色譜-質譜(GC/MS)對釀造醬油、酸水解植物蛋白調味液、醬油香精及焦糖色素的揮發性組分進行檢測分析，篩選出各自的特征差異組分，尋找能有效鑒別釀造醬油與非釀造醬油的指標，完善目前釀造醬油與非釀造醬油鑒別指標體系，建立釀造醬油和非釀造醬油鑒別檢驗方法。釀造醬油中特征組分有乙醇、異戊醇、1-辛烯-3-醇、3-甲硫基丙醇、苯乙醇等醇類物質，即釀造醬油中還原性揮發性組分較多，而且發現1-辛烯-3-醇是區別酸水解植物蛋白調味液、醬油香精及焦糖的特征差異性組分。實驗中對30個醬油樣品進行屬性判定，檢測結果分析發現國內醬油生產摻假嚴重。

鄧岳等[15]用HS-SPME-GC-MS對“非物質文化遺產”——四川省瀘州市合江縣先市醬油香味物質進行分析，共檢測出67種揮發性香味物質，其中有7種醇、10種醛、6種酮、9種酸、12種酯、5種吡嗪、5種酚、7種呋喃、4種含硫化合物及2種其他類揮發性物質，其中酸類物質含量最高，其次為醇類、酚類、呋喃類、醛類、酯類、吡嗪類、含硫類、酮類。實驗可為后期優化先市醬油生產工藝，提升傳統工藝醬油風味提供一定的指導和參考。

丁莉莉等[16]將頂空-固相微萃取技術創新，采用無溶劑萃取檢測，結合氣相色譜-質譜聯用儀，研究中日醬油在模擬蘸料和炒菜條件下揮發性呈香物質的差異。結果顯示：在模擬蘸料條件(25 ℃)下，檢測到日本醬油(3種醬油樣品)呈香酯類物質居多，其含量約是中國醬油(3種醬油樣品)的2倍；中國醬油呈香吡嗪類物質居多，是日本醬油的1.6倍。在模擬炒菜條件(95 ℃)下，日本醬油呈香物質種類增加35%，中國醬油增加59%。日本醬油中醇類、酯類和醛類物質表現突出，乙醇為日本醬油的典型呈香物質，賦予其濃厚醇香；中國醬油中吡嗪類、酯類和酮類物質占比較大，賦予其濃郁醬香，苯乙醇為中國醬油的典型呈香物質，賦予一定的花香和果香。

氣相色譜法是目前應用于醬油組分及鑒別真假研究中最多的一種方法，其快速、高效、靈敏度高，但是該法需要將樣品氣化，僅適用于對揮發性成分的分析，對非揮發性成分和很難測定的殘留物等愛莫能助。因其儀器比較昂貴、實驗成本高且需要專門操作環境，所以并不利于推廣普及。

4 液相色譜法

液相色譜檢測技術屬于食品安全檢測中的重要技術，其應用優勢集中體現在分析速度快、載液流速快，較經典液體色譜法速度快得多；分離效能高、靈敏度高，可選擇多種新型固定相以達到最佳分離效果；不受樣品揮發性和熱穩定性的限制，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差的化合物，應用范圍廣，約占80%的有機化合物可用高效液相色譜分析，因此被廣泛地運用到食品安全檢測中。

低濃度的生物胺能調節生理功能(如體溫調節和胃酸分泌)，但高濃度的生物胺對人體健康有害，微生物水解蛋白質是醬油中生物胺的潛在來源[17]。Dong等[18]研究的目的是建立一種新的分析方法，使用改良的QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe，是近年來國際上最新發展起來的一種用于農產品檢測的快速樣品前處理技術，由美國農業部Anastassiades教授等于2003年開發的)純化，然后進行UHPLC-MS/MS分析，確定醬油中的7種生物胺(酪胺、苯乙胺、組胺、色胺、腐胺、精胺和亞精胺)。所提出的方法在線性、準確度、精確度、檢測限和定量限方面得到驗證。此外，研究者從當地購買20種醬油，驗證了實驗創建的該方法在商業醬油樣品中分析生物胺中的應用，結果顯示所有樣品中均檢測到7個生物胺，濃度在46.2～1422 mg/kg之間。

醬油發酵液中含有豐富的胺基類化合物(肽、氨基酸等)和還原糖(葡萄糖、果糖等)，因而醬油生產釀造過程中發生美拉德反應是不可避免的。Amadori Product(AP)由美拉德反應產生，是醬油顏色、味道、香氣的關鍵決定因素，所以Katayama等[19]采用五氟苯丙基鍵合硅膠柱的液相色譜-串聯質譜法，建立了一種可在醬油中同時定量20種APs且無需離子配對試劑或樣品的衍生化方法。經驗證，該方法可在10 min內完全分離20種APs，適用于檢測6種醬油的總AP水平或個別APs水平，8個樣品的總AP水平差異很大，從358 mg/L到24347 mg/L，其中Fru-Lys(N-ε-(1-deoxy-d-fructosyl-1-yl)-l-lysine)和Fru-pGlu(N-(1-deoxy-d-fructosyl-1-yl)-l-pyroglutamic acid)的濃度類似，是這20種AP中最高的。另外，實驗還發現6個月的發酵時間對醬油中的AP水平影響較大，但此后保持不變，而熱處理對醬油中的AP水平幾乎無影響。

Feng等[20]為了在醬油樣品中選擇性提取4-甲基咪唑(4-MEI)，制備了磁性分子印跡聚合物(MMIP)進行高效液相色譜分析。采用掃描電鏡(SEM)、傅里葉變換紅外(FT-IR)、X射線衍射(XRD)和振動樣品磁強計(VSM)對其進行了表征。該磁性聚合物對目標模板分子具有較好的選擇性識別性能和較高的吸附能力。在較短的萃取過程中，達到了吸附和解吸的平衡，萃取后的MMIPs可以通過磁鐵快速收集。MMIPs作為醬油中4-甲基咪唑的選擇性預濃縮吸附劑，對加藥樣品的回收率為97%～105%，具有較好的回收率。實驗證明，MMIPs在確定醬油樣品中的4-MEI方面存在潛在的前景。

氨基甲酸乙酯是一種常存在于豆制品發酵產品中的2A類致癌性化學污染物，有較高的食品安全風險。黃秋婷等[21]建立了一種超高效液相色譜串聯四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜檢測醬油類調味品中氨基甲酸乙酯的方法。樣品經優化的QuEChERS方法凈化后，用高分辨質譜 QExactive進行測定。經試驗，該方法快速、高效、環境友好，且無基質效應。采用本研究建立的檢測方法對市場流通度較高的9種品牌醬油進行了測定，發現6種醬油檢測到了氨基甲酸乙酯，范圍在11.98～41.70 μg/kg。

廖敏等[22]建立了一種同時快速測定醬油中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜的高效液相色譜法。本法采用純水提取樣品，簡化了樣品前處理，加快了分析速度，操作簡易，靈敏度高，樣品在10～100 mg/kg添加水平范圍內，回收率在90%～104%，相對標準偏差均小于3%，證明適合醬油中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜的檢測。

近年來，液相色譜法尤其是高效液相色譜法多用于對醬油中非揮發性成分和有毒有害殘留物的鑒定，它對被檢測物質的活性影響相對比較小，與此同時，并不需要特別對樣品進行氣化，就可以檢測出其中非揮發性物質和很難測定的殘留物等。但是，該法預處理較為復雜，加之和氣相色譜法一樣，其儀器體型大、昂貴且對操作方法和操作環境有很高的要求，需到專門的儀器室檢測，不能隨測隨用。

5 其他技術檢測

5.1 感官分析儀器

電子鼻和電子舌能夠模仿人類的感官對氣味和滋味進行分析處理，具有客觀性和重現性，而且相對于氣相色譜、質譜等方法，它無需樣品前處理，具有操作簡便、時間短、成本低、無損樣品等優點，已在食用香辛料、調味品、肉制品等食品檢測中得到應用，有廣闊的發展前景[23-25]。

安瑩等[26]采用電子鼻對3種品牌的14個醬油樣品進行了檢測，得到的數據經過主成分分析，能夠完全區分醬油品牌，此研究為醬油品牌檢測提供了一個新思路。

曹仲文[27]對3個品牌的6個醬油樣品進行了3次平行試驗，對電子舌系統得到的數據進行處理后，醬油樣品與樣品之間、品牌與品牌之間都有明顯的區分，說明電子舌對醬油有不錯的識別能力。

易宇文等[28]將電子鼻和電子舌的檢測信號融合，對8種不同品牌醬油樣品進行了檢測，分析后發現電子鼻無法區分香氣極為相似的樣品，電子舌能夠區分這8種樣品，而兩者信號融合后，對醬油綜合評價的能力和靈敏度都明顯增強。

電子鼻與電子舌雖簡便易測，但是檢測的靈敏度和精度明顯不如氣相色譜法和液相色譜法，若要區分更多樣品則需要建立龐大的樣品數據庫，其在檢測中可以起到參考作用，但是并不能用于專業分析。

5.2 碳同位素比值質譜法

譚夢茹等[29]先利用元素分析-碳同位素比值質譜法采集了86個釀造醬油的碳同位素比值并建立了數據庫，繼而對市場上常見的58個標注釀造醬油的樣品進行了比對驗證，結果發現有15個醬油樣品摻假。但是該實驗只能鑒別碳-4來源的摻假，無法鑒別碳-3的外源性摻假，有一定的局限性。

5.3 13C核磁共振法

Kamal等[30]采用13C NMR譜結合主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)等多元統計數據分析方法，研究了不同類型醬油(生抽、老抽、紅燒、草菇生抽)的代謝組學差異。在這4種樣品中，谷氨酸、蔗糖和葡萄糖是最顯著的代謝物，另外，因生抽是原汁原味的醬油，所以它與其他3種醬油也有較大差異。

5.4 介電法

趙佳瑤[31]通過介電譜與化學計量相結合，對不同濃度的釀造醬油進行檢測，研究了頻率、溫度和濃度與醬油的介電常數、損耗因子和穿透深度之間的關系，并找到一種有效而準確的鑒定釀造醬油與配制醬油的方法，經實驗驗證，該方法具有可行性。

該研究對同一釀造醬油摻入不同濃度的酸水解植物蛋白液進行檢測，未對市面上的其他品牌醬油進行驗證，實用性有待考究。

6 展望

目前，應用于醬油組分研究的技術方法多種多樣，在釀造醬油生產過程中，由于原料的差異及生產工藝的不同，生產出的釀造醬油產品存在一定的差異；另外，醬油產品的摻假物酸水解植物蛋白調味液也存在較大的差異，給研究工作帶來了困難。上述有些方法高效可行，但是儀器精貴、成本高昂，不利于普及，另一些方法又沒有達到快速、準確、有效的檢測效果。將多種技術方法結合，建立一種既靈敏高效，又簡單便捷的方法應是研究者追求的目標。