響應面法優化超高壓提取藍莓花色苷工藝及其活性研究

王鑫，韓茜宇，薛宏坤，于國萍

(1.大理大學 公共衛生學院，云南 大理 671003；2.黑龍江國際旅行衛生保健中心，哈爾濱 150090；3.清華大學 工程物理系，粒子與輻射成像教育部重點實驗室，北京 100084；4.東北農業大學 食品學院，哈爾濱 150030)

藍莓(blueberry)果實體型小、呈誘人的藍色，是世界上最重要的漿果之一，主要種植在我國東北和西南地區。果實中富含花色苷、超氧化物歧化酶、多種維生素等活性成分[1]，大量研究表明花色苷具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤及增強視力等功效[2,3]，此外，花色苷顏色誘人，風味獨特，通常作為天然的色素和食品添加劑，被廣泛用于飲料、奶制品及膨化食品行業。藍莓是天然花色苷色素的重要來源，如何快速、高效地從藍莓中提取花色苷是當前研究的熱點。

目前，藍莓花色苷提取以傳統溶劑提取為主，但由于該方法效率低、耗時長，同時溶劑被大量消耗[4]，無法滿足高效提取花色苷的需求。近年來，越來越多的新型提取技術被廣泛用于花色苷的提取，如超聲、微波和酶制劑(纖維素酶、果膠酶和蛋白酶等)等提取技術，以上提取技術均可以有效改善花色苷的提取效率，但同時這些新技術對設備要求較高、提取條件苛刻，且提取成本較高，均存在一定的局限性。而超高壓提取技術作為物理提取方法更適用于熱敏性成分的提取，其原理是利用超高壓破壞離子鍵、疏水鍵及膜蛋白結構，從而降低活性成分的傳質阻力[5]；此外，超高壓能增強細胞膜的通透性，加速目標成分溶解[6]。對比傳統的提取技術，超高壓提取技術具有提取時間短、提取效率高、雜質少、節能、安全等特點[7]。故超高壓提取技術被廣泛應用于茶多酚、植物多糖和黃酮的提取[8-10]。在花色苷活性方面，已有研究表明藍莓經提取后獲得的花色苷提取物能有效抑制肝癌HepG2細胞的增殖。薛宏坤等[11]和劉奕琳等[12]分別研究發現藍莓果渣花色苷提取物和藍靛果花色苷乙醇洗脫物均能抑制HepG2細胞的增殖。目前，采用超高壓提取技術從藍莓中提取花色苷的工藝及其提取物抗腫瘤作用機制的研究報道較少。因此，本研究首先探究提取壓力、保壓時間、乙醇體積分數和料液比4個因素對藍莓花色苷含量的影響，并采用響應面方法優化其提取工藝參數；在此基礎上，探究藍莓花色苷提取物的體外活性及其機制，為藍莓中天然色素的開發提供了理論依據，同時拓展了天然色素在食品中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓：新鮮的藍莓于2018年7月下旬采摘于黑龍江省大興安嶺地區，樣品經除雜、清洗，置于-20 ℃冰箱中冷凍。

肝癌HepG2細胞：上海信裕生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)：常州市恒譽化工有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)：北京全式金生物技術有限公司；MTT和DMEM完全培養基：北京百奧萊博科技有限公司；乙醇、過硫酸鉀、水楊酸和鹽酸：南京中淳生物科技有限公司；三氯乙酸、硫酸亞鐵和鐵氰化鉀：天津市金中化工原料銷售有限責任公司；矢車菊素-3-葡萄糖苷(純度≥98%)：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

EVOS M7000倒置顯微鏡 賽默飛世爾科技(中國)有限公司；HPP600 MPa/30 L超高壓處理裝置 包頭科發高壓科技有限公司；DRYER真空冷凍干燥器 德國西門子公司；RE-6000AT型旋轉蒸發器 上海耀裕儀器設備有限公司；PRACTUM224-1CN分析天平 德國賽多利斯儀器有限公司；PHS-550雷磁pH計 上海儀電科學儀器有限公司；JYL-Y912九陽破壁機 杭州九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍莓粉末的制備

在試驗前，從冰箱中將冷凍的藍莓取出，室溫解凍3 h，然后將其打漿，將果漿置于真空冷凍干燥機干燥72 h，采用植物粉碎機將其粉粹，過40目篩，制成藍莓果粉，最后將果粉避光密封保存在-18 ℃冰箱中備用。

1.3.2 藍莓花色苷超高壓提取

將藍莓果粉(2.0000±0.0005) g置于真空包裝袋中，按照不同料液比加入不同體積分數的乙醇溶液，使其充分混合，封口，然后置于超高壓設備中進行提取，提取溫度為50 ℃，提取結束后，將萃取液置于離心機中以4000 r/min離心15 min，真空抽濾得上清液，將濾渣按上述方法重復提取2次，合并3次濾液，將濾液采用真空冷凍干燥機凍干，即獲得藍莓花色苷提取物粉末，置于-18 ℃冰箱中備用。

1.3.3 超高壓提取藍莓花色苷的單因素試驗

將藍莓粉末樣品(2.0000±0.0005) g作為提取對象，考察不同提取壓力、保壓時間、乙醇體積分數和料液比對藍莓粉末中花色苷含量的影響。在預試驗的基礎上，設定提取壓力100，150，200，250，300 MPa 5個水平；保壓時間2，4，6*，8，10 min 5個水平；乙醇體積分數40%、50%、60%*、70%、80% 5個水平；料液比1∶10、1∶20、1∶30*、1∶40、1∶50 (g/mL)，每組試驗重復3次(注：“*”表示當考察其他參數對花色苷含量影響時，用“*”標記的因素保持恒定水平)。

1.3.4 響應面法試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以提取壓力(X1)、保壓時間(X2)、乙醇體積分數(X3)和料液比(X4)為自變量，以花色苷含量(Y)為響應值。依據Box-Behnken試驗設計原理，優化超高壓提取藍莓花色苷的工藝。試驗因素與水平設計見表1。

表1 試驗因素與水平設計Table 1 The factors and levels design of experiment

采用響應面分析法得到二次回歸模型，見公式(1)：

(1)

式中：b0為截距回歸系數；bi為線性回歸系數；bii為二次項回歸系數；bij為交互項回歸系數；Xi，Xj為自變量。

1.3.5 藍莓花色苷含量的測定

參考于澤源等[13]的方法測定不同提取條件下藍莓中花色苷含量，具體操作：從1.3.2所得的樣品溶液中取出1 mL，然后分別加入9 mL pH 1.0 KCl緩沖液和9 mL pH 4.5 CH3COONa緩沖液，避光靜置1 h，分別在520 nm和700 nm處測定其吸光值，依據公式(2)計算藍莓中花色苷含量。

(2)

式中：c為藍莓中花色苷含量，mg/g；A為樣品的吸光值；DF為稀釋倍數；V為樣品提取液的體積，mL；Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量(449.2)；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(26900)；l為光程，1 cm；m為藍莓果粉的質量，g。

1.3.6 藍莓花色苷提取物抗腫瘤活性

1.3.6.1 HepG2細胞的培養

將HepG2細胞培養于DMEM培養基(含體積分數10% FBS、1%青霉素和鏈霉素)中，培養條件為37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養箱中培養。

1.3.6.2 MTT法測定藍莓花色苷提取物對HepG2細胞存活率的影響

采用MTT法測定不同濃度的藍莓花色苷提取物(在上述最優工藝條件下獲得的花色苷提取物)對HepG2細胞存活率的影響。操作方法同文獻[3]，并依據公式(3)計算細胞存活率。

細胞存活率(%)=As/Ac×100。

(3)

式中：As為試驗組的吸光度值；Ac為空白對照組的吸光度值。

1.3.6.3 藍莓花色苷提取物對HepG2細胞形態學的影響

調整HepG2細胞密度為1×106個/mL，以2 mL/皿接種于玻璃底小皿中，37 ℃、5% CO2培養過夜，換為終質量濃度為0，50，100，200 μg/mL藍莓花色苷提取物的DMEM培養液，37 ℃、5% CO2繼續培養48 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.6.4 藍莓花色苷提取物對HepG2細胞凋亡的影響

取對數期HepG2細胞密度調整為2.5×105個/孔，接種于60 mm細胞培養板上，培養24 h，用不同濃度(0，50，100，200 μg/mL)的藍莓花色苷提取物干預48 h，移除培養基，用胰蛋白酶消化，收集細胞，用PBS洗2次，然后采用Annexin V-FITC/PI雙標記染色法流式檢測細胞凋亡。

1.3.7 數據處理

每組試驗重復3次，結果用平均值±標準差表示；采用SPSS 22.0軟件對每組數據進行方差分析(ANOVA)，組間差異比較用Duncan檢測，P<0.05表示組間具有顯著性差異；采用Origin 9.0進行繪圖，采用Design Expert ver8.0軟件設計組合試驗。

2 結果與分析

2.1 單因素對藍莓花色苷含量的影響

超高壓提取藍莓花色苷的單因素試驗結果見圖1。

圖1 提取壓力(A)、保壓時間(B)、乙醇體積分數(C)和料液比(D)對藍莓花色苷含量的影響Fig.1 Effects of extraction pressure (A), pressure-holding time (B), ethanol volume fraction (C) and solid-to-liquid ratio (D) on the yield of anthocyanins from blueberry注：在誤差線上的不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

由圖1中A可知，當提取壓力低于200 MPa時，藍莓花色苷含量隨著提取壓力的增加呈現顯著增加趨勢(P<0.05)，當提取壓力為200 MPa時，花色苷含量達到最大值(4.61±0.05) mg/g。其原因是高壓破壞了離子鍵、疏水鍵和細胞膜上的結構蛋白，導致細胞膜通透性增加，傳質阻力降低[14]，有利于藍莓細胞中的花色苷擴散到周圍溶劑中；此外，升高的壓力能提高花色苷的傳質系數和溶解度，故花色苷提取率增加。但當壓力超過200 MPa時，繼續增加提取壓力，花色苷含量呈現顯著降低的趨勢(P<0.05)。其原因可能是過高的提取壓力破壞了花色苷結構，降低了花色苷含量，同時過高的壓力還會給提取設備增加負擔[15]，綜合考慮，選擇提取壓力150，200，250 MPa作為后續組合試驗的因素水平。

由圖1中B可知，當保壓時間在2～6 min時，隨著保壓時間延長，花色苷含量呈顯著增加趨勢(P<0.05)，當保壓時間在6 min時，花色苷含量達到最大值(4.47±0.07) mg/g。其原因是在萃取初期藍莓細胞內外的濃度梯度較大，濃度梯度作為傳質的驅動力，較大的濃度梯度有利于細胞內的花色苷大量擴散到溶劑中，使得花色苷含量顯著增加。當保壓時間超過6 min時，花色苷含量隨著保壓時間延長無顯著變化(P>0.05)。其原因是隨著保壓時間延長，內外濃度梯度趨近于零，故花色苷含量無顯著變化。綜合考慮，選擇保壓時間4，6，8 min作為后續組合試驗的因素水平。

由圖1中C可知，當乙醇體積分數在40%～60%時，隨著乙醇體積分數增加，花色苷含量顯著增加(P<0.05)。當乙醇體積分數在60%時，花色苷含量達到最大值(4.71±0.06) mg/g。其原因是60%乙醇極性與花色苷極性相似，依據相似相容原理，此時花色苷溶解度最大，花色苷含量最大[16]。當乙醇體積分數超過60%時，過高的乙醇使雜質的溶出量增加，從而降低了花色苷的溶出量，進而導致花色苷含量降低；此外，高體積分數的乙醇會破壞花色苷的結構[17]。故選擇乙醇體積分數50%、60%、70%作為后續組合試驗的因素水平。

由圖1中D可知，花色苷含量隨著料液比增加呈現先顯著增加后顯著降低的趨勢(P<0.05)。其原因是在萃取初期，隨著料液比增加，固液界面濃度梯度較大，有利于花色苷擴散到溶液中。隨后如果繼續增加料液比，過多的溶劑會引起雜質的溶解，從而降低花色苷的溶解度[18]。另外，過多的溶劑會增加對花色苷的分離純化難度。因此綜合考慮，選擇料液比1∶20、1∶30、1∶40 (g/mL)作為后續組合試驗的因素水平。

2.2 響應曲面法試驗結果

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗

采用響應面優化超高壓提取藍莓花色苷工藝參數，所得的試驗方案和結果見表2。以花色苷含量(Y)為響應值，對試驗所得的數據進行多元回歸擬合分析，得到藍莓花色苷含量對提取壓力(X1)、保壓時間(X2)、乙醇體積分數(X3)和料液比(X4)的回歸方程，見公式(4)。

表2 響應面法試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

續 表

Y=4.80+0.036X1-0.043X2+0.10X3-0.14X4+0.022X1X2+0.025X1X3+0.040X1X4-0.028X2X3+0.035X2X4-0.018X3X4-0.58X12-0.32X22-0.12X32-0.22X42。

(4)

對回歸方程系數進行顯著性檢驗，結果見表3。

表3 超高壓提取藍莓花色苷回歸模型系數的顯著性檢驗報告Table 3 Significance test report of regression model coefficients of ultra-high pressure extraction of anthocyanins from blueberry

由表3可知，所得的回歸模型決定系數R2=0.9984，F值為642.13，P值小于0.0001，表明所得模型極顯著。該模型的失擬項P值=0.8842>0.05。上述數據分析表明該模型對試驗數據擬合充分，可靠性較好。利用該模型可較好地描述各試驗因素與響應值的真實關系，并且利用該模型可以優化超高壓提取藍莓花色苷的最佳工藝條件。

依據F值大小可以判斷各試驗因素對花色苷含量影響的程度，F值越大，表明該試驗因素對提取效果的影響越顯著。由表3可知，F(X1)=46.68、F(X2)=68.26、F(X3)=363.51和F(X4)=738.14，即各試驗因素對藍莓花色苷含量的影響大小為料液比>乙醇體積分數>保壓時間>提取壓力，且4個因素對花色苷含量的影響均達到極顯著的水平。

采用響應面的坡度陡峭程度來衡量試驗因素交互作用對響應值的影響強弱，響應曲面相對平緩，說明該因素交互作用對花色苷含量影響作用較小。各試驗因素交互作用對藍莓花色苷含量的影響見圖2。

圖2 各試驗因素對藍莓花色苷含量的交互影響Fig.2 Interaction effects of experimental factors on the yield of anthocyanins from blueberry

由表3中方差分析的結果可知，X1X4、X2X4和X2X3極顯著影響花色苷含量(P<0.01)；X1X3和X1X2顯著影響花色苷含量(P<0.05)；X3X4對花色苷含量的影響不顯著(P>0.05)。由圖2中A，B和C可知，隨著提取壓力增加，花色苷含量呈先顯著增加后顯著降低的趨勢，當提取壓力在175～225 MPa范圍內，花色苷含量取得極大值。由圖2中A，D和E可知，花色苷含量隨著保壓時間的延長呈現先顯著增加后顯著降低的趨勢，當保壓時間在5～7 min范圍內，花色苷含量取得極大值。由圖2中B，D和F可知，乙醇體積分數對花色苷含量的變化趨勢較平緩。由圖2中C，E和F可知，隨著料液比增加，花色苷含量呈現先顯著增加后顯著降低的趨勢，當料液比在1∶25～1∶35(g/mL)范圍內，花色苷含量取得極大值。綜上可知，各因素交互作用對藍莓花色苷含量影響順序為X1X4>X2X4>X2X3>X1X3>X1X2>X3X4。

2.2.2 驗證試驗

通過Design Expert軟件對公式(4)的回歸方程進行分析，得到最佳提取條件：提取壓力187.28 MPa、保壓時間5.91 min、乙醇體積分數56.75%、料液比1∶29.35 (g/mL)，花色苷含量的理論值為5.02 mg/g，為驗證該方法的可靠性，考慮實際情況，將最佳工藝參數修正為：提取壓力187 MPa、保壓時間6 min、乙醇體積分數57%、料液比1∶29 (g/mL)，在此條件下進行超高壓提取藍莓花色苷的驗證試驗，所得花色苷含量的試驗值為(5.16±0.12) mg/g，理論值和試驗值相對誤差為2.79%。說明模型可以較好地模擬和預測超高壓提取藍莓花色苷含量，也進一步證明了采用響應面法優化超高壓提取藍莓花色苷提取參數的可行性。

2.3 藍莓花色苷提取物對HepG2細胞存活率的影響

不同濃度藍莓花色苷提取物對HepG2細胞存活率的影響結果見圖3。

圖3 藍莓花色苷提取物對HepG2細胞生長抑制作用的劑量效應Fig.3 Dose effect of blueberry anthocyanin extracts on inhibition of HepG2 cells’ growth注：不同小寫、大寫字母分別表示不同樣品間、不同劑量差異顯著(P<0.05)。

由圖3可知，在24，48，72 h后，HepG2細胞存活率均隨著藍莓花色苷提取物濃度增加呈現顯著降低的趨勢(P<0.05)。當藍莓花色苷提取物濃度在50 μg/mL時，處理24，48，72 h后，HepG2細胞存活率分別為(95.35±1.59)%、(90.18±2.36)%、(88.83±3.04)%；當藍莓花色苷提取物濃度在200 μg/mL時，處理24，48，72 h后，HepG2細胞存活率分別為(65.27±1.62)%、(48.19±1.96)%、(47.18±2.34)%，在24，48，72 h后，后者較前者HepG2細胞存活率分別降低了31.55%、46.56%、46.89%。

結果表明，藍莓花色苷提取物能顯著抑制HepG2細胞的增殖，且濃度越大，抑制效果越顯著，表現出顯著的劑量效應。當藍莓花色苷提取物濃度一定時，24 h后HepG2細胞存活率顯著高于48 h和72 h(P<0.05)，而48 h和72 h后，HepG2細胞存活率無顯著差別(P>0.05)，因此，后續試驗細胞培養選擇48 h。

2.4 倒置顯微鏡觀察藍莓花色苷提取物對HepG2細胞形態的影響

不同質量濃度藍莓花色苷提取物(0，50，100，200 μg/mL)作用48 h后HepG2細胞形態變化結果見圖4。

圖4 不同質量濃度的藍莓花色苷提取物對HepG2細胞形態學的影響Fig.4 Effects of blueberry anthocyanin extracts with different concentration on morphology of HepG2 cells

由圖4可知，當藍莓花色苷提取物濃度為0 μg/mL時，細胞完全貼壁，細胞緊密相連，細胞數目較多。當采用藍莓花色苷提取物干預HepG2細胞時，隨著藍莓花色苷提取物濃度增加，HepG2細胞數目顯著降低，且細胞體積減小，大多數細胞由開始的菱形變成橢圓形，同時伴隨凋亡小體的產生。

2.5 藍莓花色苷提取物對HepG2細胞凋亡的影響

不同質量濃度藍莓花色苷提取物(0，50，100，200 μg/mL)干預HepG2細胞48 h后癌細胞凋亡情況見圖5。

圖5 藍莓花色苷提取物對HepG2細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of blueberry anthocyanin extracts on apoptosis of HepG2 cells注：A為流式檢測藍莓花色苷提取物處理HepG2細胞48 h凋亡；B為流式檢測的統計結果分析。

目前，大量的研究已經證實藍莓花色苷提取物具有顯著的抗氧化能力[19]，同時又能顯著抑制癌細胞的增殖，加速癌細胞的凋亡[20]。因此，本試驗在MTT的基礎上，進一步探究藍莓花色苷提取物對HepG2細胞凋亡的影響。由圖5可知，當藍莓花色苷提取物濃度為50，100，200 μg/mL時，HepG2細胞凋亡率分別為(5.76±0.43)%、(28.60±0.81)%和(40.40±1.27)%。結果表明，藍莓花色苷提取物能顯著提高HepG2細胞凋亡率，且藍莓花色苷提取物濃度越大，HepG2細胞凋亡率越高，呈劑量效應。

3 結論

采用響應面法對藍莓花色苷超高壓提取工藝進行優化，確立最優的工藝參數組合為：提取壓力187 MPa、保壓時間6 min、乙醇體積分數57%、料液比1∶29 (g/mL)，在此條件下花色苷含量為(5.16±0.12) mg/g。體外抗腫瘤活性表明藍莓花色苷提取物能顯著抑制HepG2細胞增殖，加速其凋亡。本研究結果為天然色素的快速提取提供了一種有效的手段，同時為開發功能性的食品添加劑提供了理論基礎。