基于PCR-DGGE法分析醬菜中乳酸菌群落結構

燕平梅，昝宏雷，趙文婧，陳燕飛，喬宏萍

(1.太原師范學院 生物系，太原 030619；2.土壤消毒活化綠色產業技術創新戰略聯盟，太原 030619)

醬菜，一種歷史悠久的中國特色小菜，是將新鮮的蔬菜先用高濃度的鹽水腌制后，通過清水沖洗或者壓榨等方法，使腌制蔬菜中的食鹽濃度降低，之后再次用醬來醬制，這些醬包括醬油、甜面醬、干黃醬、黃醬等，通過這種方法制作的蔬菜中含有醬的糖分、氨基酸及維生素等多種營養物質，因此，醬菜成為了中國人愛吃的下飯小菜[1，2]。醬菜自然發酵過程是乳酸菌主導的多種微生物的代謝過程，多種代謝產物和所需低氧環境能夠抑制其他食物腐敗細菌、霉菌及真菌等微生物生長，從而能使醬菜保持其獨特風味而不容易變質。

但是，在生產過程中醬菜很容易生成亞硝酸鹽，這樣則不利于健康。

研究醬菜中微生物多樣性的方法有兩種，培養法和非培養法，培養方法是通過應用涂布平板的方式計數并統計，得出最終的微生物多樣性結論；非培養法則是通過生化分子的方法研究。非培養方法即基于PCR的變性梯度凝膠電泳，在變性膠梯度電泳中不同序列DNA遇上不同的變性膠濃度而解鏈，停留在解鏈位置，從而形成相互分開的條帶圖譜[3]。隨著微生物分子生態學技術的發展，更多的人選擇避開純培養過程中工作量大、繁瑣的弊端，而是直接從分子水平上來研究各種樣品中微生物區系組成和群落結構[4]。其中，韓國和日本對泡菜的研究較早，在泡菜的研究上運用PCR-DGGE技術也比較多[5，6]。梁新樂等[7]應用PCR-DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)技術，分別以細菌16S rDNA 的V7～V8區和V3區為引物，研究泡菜樣品乳酸菌多樣性，結合Quantity One軟件，分析計算泡菜中微生物群落結構，并得到了可靠的結果[8]。Rademaker等將該技術運用到酸奶和干酪發酵研究中，通過監測發酵劑的消長動態，研究了乳酸菌的生理變化，建立了T-RFLP信號強度與實際微生物數量的定量關系[9]。本實驗以發酵成熟的兩種醬菜樣品為實驗材料，以細菌16S rDNA的V7～V8區為引物，探究醬菜中微生物群落結構。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種醬菜(黃瓜)：購于太原市沃爾瑪超市、美特好超市和華聯超市。根據含鹽量分為兩類：一類含鹽量低的醬菜用JA表示，另一類含鹽量高的醬菜用JB表示。細菌基因組DNA提取試劑盒：天根時代生物有限公司。

1.2 儀器與設備

DcodeTM型凝膠成像儀、變性梯度凝膠電泳儀 Bio-Rad公司；TC-96(G)H(b)B基因擴增儀 杭州博日科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 醬菜鹵亞硝酸鹽含量和食鹽濃度的測定

亞硝酸鹽按照國標GB/T 5009.33-2008《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》進行測定[10]。

泡菜鹵食鹽濃度采用硝酸銀滴定法進行測定。

1.3.2 16S rDNA V7～V8片段的PCR

16S rDNA V7～V8片段的上下引物分別為：WBAC1：CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCCGGGAACGTATTCACCGCG；WBAC2：GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA。

模板DNA1.5 μL，引物1 μL(10 μg)，Mix 12.5 μL，PCR反應物共25 μL。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果。

1.3.3 16S rDNA 的V7～V8基因片段DGGE

取PCR產物20 μL進行DGGE實驗，變性劑梯度范圍為30%～55%。聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(其中變性劑由尿素濃度為7 mol/L和40%的去離子甲酰胺組成)。200 V、60 ℃下電泳 4 h。采用SYBR Green染色。

從DGGE電泳結果中回收電泳帶，以其中的DNA為模板PCR反應，將PCR產物與pGM-T Vector載體連接，轉化細胞，測序鑒定陽性克隆。

1.3.4 DGGE條帶結構分析

DGGE圖譜用Quantity One軟件分析。用電泳條帶的光密度峰值除以該條帶所在泳道所有條帶光密度峰值的平均值。DGGE泳道內的電泳條帶數量用以計算物種豐富度(R)，由電泳帶相對密度計算微生物均勻度(E)及微生物多樣性(H)[11]。3種生態指數計算公式為：

H=-∑(ni/N)In(ni/N)；

E=H/InS；

R=S-1/InN。

式中，ni為單一條帶的峰面積，N為某一泳道所有峰面積，S為某一泳道的總條帶數。

1.3.5 系統發育分析方法

將16S rDNA V7～V8序列提交GenBank中進行BLAST比對，選出與其相似度高的序列，利用MEGA 4.0軟件的Neighbor-Joining法構建系統發育樹，進行系統發育分析。

1.3.6 數據處理

實驗重復3次，采用SPSS軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 醬菜中氯化鈉濃度和亞硝酸鹽含量

不同醬菜中氯化鈉濃度和亞硝酸鹽含量見表1，兩類醬菜中JB食鹽濃度要高于JA。低食鹽濃度的醬菜JA的亞硝酸鹽含量高于食鹽濃度高的醬菜JB，但是，兩種醬菜中亞硝酸鹽含量遠低于我國GB 2762-2012中規定的蔬菜及其制品腌漬蔬菜中亞硝酸鹽限量指標(20 mg/kg)，都處于國家安全標準內。

表1 不同醬菜中氯化鈉濃度和亞硝酸鹽含量Table 1 The content of sodium chloride and nitrite in different pickles

2.2 PCR-DGGE結果

由上海生工生物工程技術服務有限公司合成設計的乳酸菌通用引物進行DNA擴增反應，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用紫外成像儀觀察，之后用Bio-Rad公司凝膠成像系統拍照，見圖1中A。電泳條帶清晰，無雜帶，提取的DNA質量可以滿足DGGE實驗的需要。PCR擴增乳酸菌DNA片段后，進行DGGE凝膠電泳，獲得乳酸菌DNA區段的DGGE凝膠圖譜(見圖1中B)，利用Quantity One 軟件對DGGE 凝膠圖譜中JA和JB兩個樣品進行分析，軟件指示樣品有7條條帶，其在DGGE膠上表現為條帶位置不同、粗細不一、亮暗不同，樣品JA和JB中分別含有3，4種微生物，其中3號和6號位置一致，表明兩個樣品中都有該種微生物；其中1號和4號較粗較亮，說明這兩種菌含量較高，從乳酸菌 DNA 樣品中共分離得到 7條條帶，6種不同的DNA，說明醬菜樣品JA和JB乳酸菌共檢測到6種不同的DNA信息。

圖1 PCR擴增產物的電泳結果(A)和DGGE電泳結果(B)Fig.1 Electrophoresis results of PCR amplification products (A) and DGGE electrophoresis results (B)

乳酸菌群落結構見表2，兩種醬菜微生物豐富度和多樣性指數差異顯著，低鹽醬菜的豐富度和多樣性值顯著高于高鹽醬菜(P<0.05)。兩種醬菜微生物均勻度無顯著差異(P>0.05)。JA和JB相比，說明食鹽對醬菜乳酸菌群落結構有影響。

表2 乳酸菌群落結構Table 2 The community structure of lactic acid bacteria

為了研究醬菜中的微生物種類，回收DGGE電泳結果的條帶，通過PCR反應，測定PCR產物堿基序列，提交GenBank庫中與已知序列對比而做出鑒定。 JB樣品即高鹽醬菜的PCR-DGGE泳帶有3條，經鑒定。1，2，3與γ-Proteobacterium，Lactobacillus，UnculturedLactobacillus的相似度分別為95%、97%、96%，見表3。JA樣品即低鹽醬菜的PCR-DGGE泳帶有4條，經鑒定，4，5，6，7與Lactobacillus， UnculturedLactobacillus，Lactococcussp.， γ-Proteobacterium的相似度分別為97%、95%、97%、92%，見表3。

表3 DGGE圖譜條帶測序結果Table 3 The sequencing results of DGGE graph bands

基因序列及參比序列構建的系統發育樹見圖2和圖3。食鹽含量對微生物影響很大[12-15]。通常高濃度食鹽有利于酵母菌生長，而低濃度食鹽則有利于乳酸菌生長[16-18]。低溫下6%食鹽濃度比8%的能更好地促進乳酸菌生長[19]。低鹽醬菜中檢測到乳酸桿菌(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcussp.)，高鹽醬菜中檢測到乳酸桿菌(Lactobacillus)，未檢測到乳球菌屬(Lactococcussp.)，可能是食鹽濃度高抑制了乳球菌這類乳酸菌的生長。

將測出條帶序列與NCBI庫已有序列比對，選取比對結果高相似度的構建系統發育樹，樣品JA和樣品JB所有微生物輸入Clustal X2中構建系統發育樹，見圖2和圖3。

圖2 高鹽醬菜JB微生物16S rDNA V7～V8片段基因序列及參比序列構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed by high-salt pickle JB microbial 16S rDNA V7-V8 fragments’ gene sequence and reference sequence

圖3 低鹽醬菜JA微生物16S rDNA V7～V8片段基因序列及參比序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed by low-salt pickle JA microbial 16S rDNA V7～V8 fragments’ gene sequence and reference sequence

3 結論

運用PCR-DGGE法研究兩類醬菜DGGE圖譜，進行乳酸菌群落結構分析，高鹽醬菜乳酸菌的多樣性指數和豐富度指數顯著低于低鹽醬菜。兩種醬菜樣品中既有相同序列的乳酸菌，又有序列不同的乳酸菌，回收電泳DNA序列鑒定的微生物、γ-Proteobacterium和乳酸桿菌(Lactobacillus)是兩種醬菜共有的微生物。低鹽醬菜中檢測到乳酸桿菌(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcussp.)，高鹽醬菜中檢測到乳酸桿菌(Lactobacillus)，未檢測到乳球菌屬(Lactococcussp.)，可能是食鹽濃度高抑制了乳球菌這類乳酸菌的生長。

由本實驗研究可知，高濃度食鹽影響醬菜中乳酸菌的多樣性和豐富性。與低濃度食鹽濃度相比，高濃度食鹽濃度抑制乳酸菌的生長。