酶法-超聲聯合提取紫色馬鈴薯花青素的工藝研究

洪豆，阿麗雅，江宇峰，朱玲麗，吳淑清*

(1.長春大學 食品科學與工程學院，長春 130022；2.浙江李子園食品股份有限公司，浙江 金華 321031)

紫色馬鈴薯又名黑土豆，富含大量的優質蛋白質、氨基酸、維生素等營養物質，此外，還富含花青素[1]，花青素具有清除自由基、抗癌及抑菌等生理活性功能[2-4]。紫色馬鈴薯花青素屬于天然色素，其在食品、醫學、化妝品等領域均有應用[5]。因此，紫色馬鈴薯將成為未來重要的糧食作物和食品、醫藥原材料，必將具有廣闊的發展前景[6]。

目前，紫色馬鈴薯花青素的提取主要以溶劑法和超聲提取法為主[7,8]，而采用酶法-超聲聯合技術提取紫色馬鈴薯花青素的研究鮮有報道。由于紫色馬鈴薯含有大量的纖維素[9]，利用纖維素酶可將其纖維素水解，有效地破壞細胞壁和細胞膜，加速花青素的溶出，從而達到提高提取率的目的[10]。超聲波產生的機械作用能擊破細胞結構，加快體系的傳質和傳熱速度，加速有效成分的擴散和浸出[11]。綜上，本試驗采用酶法-超聲聯合技術提取紫色馬鈴薯花青素，并對其提取工藝條件進行優化，為此類花青素的開發利用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色馬鈴薯：市售；纖維素酶：酶活≥50 U/mg，上海橋星貿易有限公司；鹽酸、乙醇：分析純，上海研生生化試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Christ ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；BH1200R超速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；KQ2200超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-2700紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 花青素提取

將紫色馬鈴薯洗凈，將表皮水分用濾紙拭干后切成1 cm的薄片后，快速地于-20 ℃下預凍24 h。24 h后真空冷凍干燥，粉粹過80目篩得到紫色馬鈴薯粉，置于密閉容器中備用。準確稱取1.0 g紫色馬鈴薯粉置于250 mL錐形瓶中，加入體積分數為0.1%的HCl-C2H5OH溶液(酸醇比為1∶1)和纖維素酶，于200 W超聲提取，然后以7000 r/min的轉速離心15 min，取上清液。定容后測定花青素提取液的吸光度，計算花青素含量。

1.3.2 花青素含量計算

采用pH示差法對提取后的花青素進行定量分析[12]。在試驗中，每個樣本進行3次吸光值的測定，得出的數據為9次測定的平均值。根據pH示差法，按下式進行計算：

式中：A為吸光值，A=(A530 nm-A700 nm)pH 1.0- (A530 nm-A700 nm)pH 4.5；MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2 g/mol；DF為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數26900 L/(mol·cm)；L為光程，1 cm；m為原料質量，g。

1.3.3 工藝優化

1.3.3.1 單因素試驗設計

將料液比、酶添加量、超聲時間、超聲溫度分別設為單因素，再分別改變單一因素用量，其他條件不變。以花青素含量為評價指標，采用單因素試驗確定各因素的最適范圍。單因素試驗因素與水平設計見表1。

表1 單因素試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels of single factor experiments

續 表

1.3.3.2 工藝條件的響應面試驗

利用Box-Behnken試驗設計原理，以花青素含量(Y)作為響應值，通過Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行處理，確定紫色馬鈴薯花青素最優的提取工藝，試驗因素與水平見表2。

表2 響應面試驗因素及水平表Table 2 Factors and levels of response surface test

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對花青素提取的影響

由圖1可知，隨著料液比的增加，花青素含量呈先升后降的趨勢，當料液比為1∶30 (g/mL)時，花青素含量達到最高值。隨著溶液量的增加，提取液和紫色馬鈴薯粉末之間的接觸面積增大，這更利于纖維素酶對紫色馬鈴薯細胞壁纖維素的降解，使得細胞迅速破裂，加快花青素的溶出[13]。但是隨著料液比的不斷增加，提取液中纖維素酶的濃度隨之減小，酶解反應速率降低。因此，選擇1∶30 (g/mL)作為最佳料液比。

圖1 料液比對花青素提取的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction of anthocyanins

2.1.2 酶添加量對花青素提取的影響

由圖2可知，當酶添加量增加時，花青素含量呈現先緩慢增加后迅速增加的趨勢，酶添加量達到4 mg/g時花青素含量達到最高值，之后趨勢基本保持穩定。這是因為酶降解細胞壁有利于花青素的溶出。當酶添加量≤4 mg/g時，細胞壁開始被降解，花青素含量開始緩慢增加；隨著酶添加量增加，細胞壁降解增多，導致花青素含量迅速增加。當酶添加量達到4 mg/g時，細胞壁降解完全，故此時花青素含量達到最高值。而當酶添加量>4 mg/g時，細胞壁的降解已經比較充分，花青素的溶出量基本保持穩定，繼續添加酶對提高花青素含量的效果不明顯。因此，選擇4 mg/g作為最佳酶添加量。

圖2 酶添加量對花青素提取的影響Fig.2 Effect of enzyme additive amount on extraction of anthocyanins

2.1.3 超聲時間對花青素提取的影響

由圖3可知，隨著超聲時間的增加，花青素含量呈先升后降的趨勢，在30 min時，花青素含量達到最高值。在超聲初期，溶劑中花青素含量少，紫色馬鈴薯粉末中花青素含量多，兩個體系間存在較高的濃度差，傳質推動力大，所以花青素溶出快。但當提取時間繼續增加時，由于花青素的熱穩定性較差，長時間高溫提取會導致花青素發生變性，溶液中的花青素含量會降低。因此，選擇30 min作為最佳提取時間。

圖3 超聲時間對花青素提取的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction of anthocyanins

2.1.4 超聲溫度對花青素提取的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，花青素含量呈先升后降的趨勢，40 ℃時花青素含量達到最高值。這說明在一定范圍內升高溫度有利于花青素的提取，升高溫度能提高花青素的溶解度和擴散系數，也有利于提高細胞膜的通透性，從而提高花青素的提取率。但高溫容易導致花青素被氧化或降解，所以當超聲溫度高于40 ℃時花青素含量會降低[14]。因此，選擇40 ℃作為最佳提取溫度。

圖4 超聲溫度對花青素提取的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction of anthocyanins

2.2 響應面試驗結果及分析

在單因素試驗的基礎上，以料液比(A)、酶添加量(B)、超聲時間(C)、超聲溫度(D)為影響因素，以花青素含量(Y)作為響應值，通過Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗數據進行處理，確定紫色馬鈴薯花青素最優的提取工藝條件，試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Response surface test design and results

續 表

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3中結果進行回歸方程擬合，得到花青素含量的響應面回歸方程：

Y=1.23+0.030A+0.021B+0.046C+0.033D-0.022AB-(3.750×10-3)AC-0.034AD+(4.500×10-3)BC-0.046BD-(4.250×10-3)CD-0.073A2-0.076B2-0.085C2-0.046D2。

根據響應面設計方案進行回歸模型方差分析，結果見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression models

由表4可知，當模型F=12.95時，P<0.0001，說明該模型是極顯著的，當失擬項F=4.02時，P=0.0959>0.05，說明模型的失擬項不顯著。決定系數R2=0.9283，校正決定系數RAdj2=0.8566，表示花青素含量的實際值和預測值之間有較好的擬合度，因而證明該模型能夠很好地對紫色馬鈴薯花青素的提取工藝進行分析和預測。該模型中的C、A2、B2和C2對結果影響極顯著(P<0.0001)，A、D、BD和D2對結果影響較顯著(P<0.01)，B和AD對結果影響顯著(P<0.05)。影響花青素含量的主次順序為超聲時間>酶添加量>料液比>超聲溫度。

利用Design-Expert軟件對回歸方程進行運算，分別做出兩個交互項之間的等高線圖，結果見圖5。在試驗所選擇的水平范圍內，因素AD、BD之間交互作用對花青素含量的影響相似，隨著因素水平的增加，花青素含量都呈現先增加達到最大值后又降低的趨勢，響應值存在最大值，即因素AD、BD之間有一定交互作用。

圖5 因素AD、BD之間對花青素含量交互影響的響應面圖Fig.5 Response surface diagrams of the interaction effects between AD and BD on anthocyanin content

通過Design-Expert軟件對已建立的回歸方程進行優化分析，得到最佳提取工藝條件為料液比1∶30 (g/mL)、酶添加量4 mg/g。超聲時間30 min、超聲溫度40 ℃。在此提取工藝條件下提取的紫色馬鈴薯花青素含量理論值可達到1.25 mg/g。

2.3 驗證試驗

為了檢驗響應面法所得結果的可靠性，對上述結果進行驗證試驗，條件設定為料液比1∶31.2 (g/mL)、酶添加量4.04 mg/g、超聲時間33 min、超聲溫度43 ℃，經過3次平行試驗，實際測得花青素含量為(1.24±0.004) mg/g，與預測值相近，說明試驗優化得到的技術參數是可靠、穩定的。

3 結論

紫色馬鈴薯花青素屬于天然植物色素，相較于合成色素安全性更高，并且具有很高的營養和保健價值，可用于食品、醫藥等領域，具有十分廣闊的應用前景[15]。本研究采用酶法-超聲聯合提取法，對紫色馬鈴薯花青素的提取工藝進行了研究。根據響應面法優化提取工藝，得到最佳工藝條件為料液比1∶30 (g/mL)、酶添加量4 mg/g、超聲時間30 min、超聲溫度40 ℃。在此條件下紫色馬鈴薯花青素的提取含量可達(1.25±0.002) mg/g。該結果可為深層次開發天然色素的研究提供理論依據，并有益于紫色馬鈴薯花青素在食品工業中的推廣與應用[16]。