紫紅曲霉A13、Fen發酵紅曲米中莫納克林K的含量測定

劉潤璞，孫曉東，李雨恒，韋睿

(大連民族大學 環境與資源學院，遼寧 大連 116600)

紅曲米是我國傳統的發酵食品，外表呈現棕紅色，質地脆，斷面紅色，略有酸味，是利用紅曲霉在大米中發酵而成[1]。制作時將大米蒸制熟透，以紅曲霉接種，使得真菌能夠相互擴散、傳播、生長發酵。紅曲霉(Monascus)是一種典型的絲狀真菌[2，3]，也是我國在釀造微生物方面重要的一個屬，迄今已有上百年歷史。古籍中對其在食品中的應用及功效早有記載，早在北宋時期，“紅曲煮肉”就已在陶古的《清異錄》中被提及，李時珍撰寫的《本草綱目》中也提及紅曲霉能夠“健脾燥胃，治赤白痢”[4]。紅曲霉是能夠產生多種具有聚酮結構次生代謝產物的菌種[5，6]，其中的次級代謝產物——日本遠藤章教授從紅曲霉中分離出的莫納克林K，能夠有效抑制膽固醇合成，高效且低毒地降低血脂[7]。其市場需求量很大，目前已廣泛應用于醫藥、保健品、食品等相關領域。眾多學者對其功能性、安全性、結構及作用機理等進行了廣泛且深入的研究，取得了令人矚目的成果[8]。本研究是利用從丹東家庭自制豆醬中分離得到的紫紅曲霉發酵產生紅曲米，并從中粗提莫納克林K，對其含量進行測定。該研究為提高紅曲米的品質及藥用價值，篩選莫納克林K生產菌奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紫紅曲霉A13、Fen：均分離自丹東地區家庭自制豆醬。

1.1.2 試劑

磷酸、甲醇、乙醇(均為色譜純)：天津科密歐化學試劑有限公司；高效液相用乙腈(色譜純)：德國默克公司；莫納克林K標準品(純度≥98%)：上海源葉生物科技有限公司；水(超純水)。

1.1.3 主要培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖15 g，水1000 mL，pH自然，用于紅曲霉菌株的純化；液體種子培養基：葡萄糖60 g，蛋白胨25 g，NaNO32 g，KH2PO4·3H2O 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，水1000 mL，pH 5.5；大米固體培養基：泰國秈米，購于超市。

1.2 儀器與設備

HZQ-Q全溫震蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；101-3AB電熱恒溫鼓風干燥箱 上海坤天實驗室儀器有限公司；752N分光光度計 上海精科實業有限公司；LS-100HD壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫療設備有限公司；HH-3D恒溫水浴鍋 上海儀純實業有限公司；SW-CJ-2D雙人凈化工作臺 上海滬凈凈化設備有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將低溫保存的紫紅曲霉菌株A13、Fen轉接于PDA平板中，于25 ℃黑暗培養7 d。

1.3.2 液體發酵

將活化的紫紅曲霉A13、Fen分別接種于裝有種子培養基的三角瓶中，加入少量滅菌的玻璃珠(打碎菌絲)，于28 ℃、180 r/min培養7 d。

1.3.3 固體發酵

使用秈米制作大米固體培養基。選取優質秈米進行浸泡處理，使米粒充分吸水膨脹后打散，瀝干水分，分裝至500 mL罐頭瓶中，每瓶裝100 g米及50 g水，調pH至5.0，使用封口膜封緊瓶口，于121 ℃滅菌60 min。在超凈臺中將液體發酵得到的菌液接種到大米固體培養基中，接種量為20 mL。分別設置3個重復，于28 ℃恒溫培養15 d。

發酵結束后，將得到的紅曲米散開攤平，置于60 ℃烘干箱中，直至其干燥并碾碎保存。

1.3.4 莫納克林K含量的測定

準確稱取20 mg莫納克林K標準品，使用甲醇溶解并定容到100 mL，得到200 mg/L標樣作為標準儲備液。用標準儲備液分別配制5，10，20，50，100，150 μg/mL 6份標準液，于4 ℃保存。

準確稱取烘干并粉碎的固態發酵產物紅曲米0.50 g于25 mL比色管中，用70%乙醇分3次進行萃取，定容至刻度線，萃取溫度為50 ℃。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱溫：28 ℃；檢測波長：238.0 nm；流動相：乙腈∶0.1%磷酸溶液為65∶35(V/V)；進樣量20 μL；流速：1.0 mL/min；所有樣品均經過0.45 μm濾膜過濾后方可使用。

莫納克林K含量計算公式：

式中：M為紅曲米中莫納克林K的含量，mg/g；ρ為通過標準曲線計算的莫納克林K的濃度，μg/mL；V為加入萃取液的體積，mL；m為樣品稱取的質量，g。

2 結果與分析

2.1 莫納克林K標準曲線的繪制

標準溶液依照上述方法進樣檢測后，以峰面積為縱坐標，莫納克林K濃度為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，得到回歸方程為y=1.3949x+47.917(R2=0.9998)，莫納克林K在5～150 μg/mL內線性關系良好，結果見圖1。

圖1 莫納克林K溶液標準曲線Fig.1 Standard curve of Monacolin K solution

2.2 莫納克林K含量的測定

通過計算得到紫紅曲霉A13和Fen固態發酵產物紅曲米中莫納克林K的含量，結果見表1。

表1 紫紅曲霉A13和Fen固態發酵產莫納克林K含量Table 1 The content of Monacolin K fermented by Monascus purpureus A13 and Fen

由表1可知，兩種紫紅曲霉發酵物中產生莫納克林K的平均含量：A13為1.79 mg/g，Fen為8.53 mg/g。實驗中，每種菌設置的3個重復均呈現出一定程度的差異，由此推測兩株紫紅曲霉發酵產莫納克林K具有相對的穩定性，繼代接種后菌株個體存在差異，這直接導致發酵產生莫納克林K的能力也存在小范圍的差異。

3 討論

紅曲霉發酵所得的次級代謝產物莫納克林K對治療由高膽固醇引起的高血脂、冠心病等有明顯的療效。研究表明，與人工合成或從其他微生物中提取得到的莫納克林K相比，紅曲霉發酵而成的莫納克林K具有溶解度更高、毒副作用較小等特點，因此療效更顯著[9]。本實驗所使用的紫紅曲霉A13、Fen均分離自丹東家庭自制豆醬，在相同固態發酵條件下，紫紅曲霉Fen較A13發酵產莫納克林K的量更高。常聰等利用紫外誘變的方法得到紅曲霉QH12，固態發酵產物中莫納克林K產量為1.68 mg/g[10]；劉穎等從不同的紅曲類產品中篩選得到的紅曲霉NW3-2產量為3.20 mg/g[11]。Suraiya Sharmin 等以褐海藻作為發酵基質，盧穎以燕麥作為發酵基質，分別得到莫納克林K產量高達13.98 mg/g和19.81 mg/g[12,13]。利用大米為發酵基質，紫紅曲霉Fen發酵得到的次級代謝產物莫納克林K較上述報道的紅曲米中的產量略高，而低于改良或者其他基質中的產量。研究表明，紫紅曲霉Fen具有一定的發酵產莫納克林K的能力，可以在后續的實驗中挖掘最優的培養基質，并優化其發酵條件。

本研究為首次從丹東家庭豆醬中分離得到紫紅曲霉，從豆醬中分離得到的紫紅曲霉在豆醬發酵過程中亦起著重要作用。紅曲霉分泌的糖化酶能夠與α-淀粉酶共同作用將淀粉徹底降解為葡萄糖，進而為其他代謝提供原料，同時也成為豆醬甜味的重要來源。某些紅曲霉也能夠分泌酯化酶，催化低級脂肪酸酯的合成以及酯的水解[14]。此外，紅曲霉還有一定的抑菌作用[15]。A13和Fen分離自豆醬發酵后期，推測其也為豆醬后期顏色加深起到了一定的作用。

本研究將為篩選功能優良的紅曲霉菌種、提高次生代謝產物莫納克林K產量和品質奠定理論基礎。