細菌型豆豉中嘔吐型蠟樣芽孢桿菌的產毒研究

貢獻，佟碩秋，吳擁軍

(貴州大學 生命科學學院，山地植物資源保護與種質創新教育部重點實驗室，山地生態與農業生物工程協同創新中心，貴陽 550025)

豆豉是我國一種傳統的大豆發酵產品，具有悠久的歷史。因其獨特的風味和口感、極高的食用價值、一定的藥理作用[1]，深受廣大消費者的喜愛。同時，近年來隨之出現的豆豉中毒事件也備受廣大群眾的關注。研究者對豆豉發酵過程中菌群的動態變化進行了研究，發現豆豉在發酵過程中受到不同雜菌的污染[2]。目前在豆豉中毒事件中，報道的病原菌主要有肉毒桿菌[3]、大腸桿菌[4]、蠟樣芽孢桿菌[5]，而豆豉中毒事件中70%都是由于蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus，BC)污染豆豉以及其產毒所導致的。

蠟樣芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，是一種主要由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌與粉紅鐮刀菌產生的B型單端孢酶烯族化合物[6]，其生長溫度范圍較廣(10～45 ℃)，是一種好氧產孢菌，可生長于pH值2～11的條件下，在無鹽環境下生長良好，當氯化鈉濃度為1%時生長最佳，8%時有抑制作用[7]。蠟樣芽孢桿菌廣泛存在于食物中，易引起食物中毒[8]。由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒，有嘔吐型和腹瀉型兩種。腹瀉型蠟樣芽孢桿菌主要由腹瀉型腸毒素引起，多見于美國，該毒素不耐熱，一般通過加熱即可使其失活，腹瀉型中毒主要與蠟樣芽孢桿菌的活菌數有關[9]。而嘔吐型蠟樣芽孢桿菌中毒主要由嘔吐毒素基因ces翻譯的耐熱性腸毒素嘔吐素(cereulide)引起，嘔吐型蠟樣芽孢桿菌中毒僅與產嘔吐毒素菌株的活菌數有關。在我國嘔吐型蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒十分常見[10]，感染該毒素的患者伴有腹痛、腹瀉、惡心嘔吐、無發熱[11,12]。蠟樣芽孢桿菌在室溫20 ℃左右能很好繁殖, 且具有形成耐熱芽孢的特性,通常食品加熱烹調(熱沖擊) 無法使該菌的芽孢失活, 芽孢則會殘存發芽[13]，并釋放毒素。研究發現cereulide的劑量在5～10 ng/g會引起食物中毒[14,15]，對食品的安全性造成嚴重隱患。

研究通過對蠟樣芽孢桿菌計數結果為陽性的豆豉樣本提取其宏基因組，利用嘔吐毒素ces基因特異性引物，對蠟樣芽孢桿菌陽性豆豉樣本中嘔吐毒素基因ces進行PCR擴增，檢測樣本中嘔吐型蠟樣芽孢桿菌，檢出率為92.6%，結果揭示了蠟樣芽孢桿菌陽性豆豉樣本中嘔吐型BC的存在情況。而后，采用超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)對自然發酵和純種強化發酵豆豉成品中所含的嘔吐毒素cereulide進行定量檢測[16]，發現自然發酵和純種發酵豆豉中嘔吐毒素cereulide含量分別為(0.0106±0.0006) μg/kg和(0.029±0.0002) μg/kg，遠低于我國國標GB 2761-2017中規定的發酵豆制品中次生有毒代謝產物的限定含量5 μg/kg[17]。通過對嘔吐型蠟樣芽孢桿菌產生的cereulide進行定量分析，對豆豉的食用安全性進行評價，表明該細菌型豆豉短時間內暫不存在cereulide超標引發的安全性問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：蠟樣芽孢桿菌，為實驗室保藏菌株。

取貴陽某食品廠的自然發酵不同發酵時期蠟樣芽孢桿菌陽性豆豉樣本18個(ZR6h、ZR12h、ZR18h、ZR24h、ZR30h、ZR36h、ZR42h、ZR54h、ZR60h、ZR66h、ZR72h、ZR1d、ZR2d、ZR3d、ZR4d、ZR5d、ZR6d、ZR7d)，純種發酵不同發酵時期蠟樣芽孢桿菌陽性豆豉樣本9個(CZ0h、CZ6h、CZ1d、CZ2d、CZ3d、CZ4d、CZ5d、CZ6d、CZ7d)，共27個陽性豆豉樣本(實驗中使用的蠟樣芽孢桿菌陽性豆豉樣本中，蠟樣芽孢桿菌含量均未超過105CFU/g)。

Takara Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒;Takara 2×Taq Master Mix; 引物由上海生工生物工程公司進行合成;cereulide標準品(HPLC 級)：購于德國Merck公司;本研究所用全部化學試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS全自動高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SW-CJ-IFD標準型凈化工作臺 上海錦星科學儀器有限公司；TGL-161高速臺式離心機 美國Sigma公司；XO超聲波細胞破碎儀 南京先歐儀器制造有限公司；My-Cycler PCR、Gel Doc XR凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；Masslynx工作站 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 豆豉中嘔吐型蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素ces基因檢測

1.3.1.1 蠟樣芽孢桿菌DNA提取

采用普通熱裂解法提取DNA[18]。

1.3.1.2 豆豉樣本宏基因組DNA提取

豆豉樣本宏基因組DNA提取采用Takara Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取基因組。樣品預處理過程如下：

從實驗室前期篩選的27個蠟樣芽孢桿菌陽性豆豉樣本中，各取5 g豆豉置于10 mL無菌PBS(pH 7.2)緩沖液中，150 r/min，離心30 min后沉降5 min；吸取1 mL菌懸液，12000 r/min，離心2 min，棄上清；加1 mL無菌水重懸清洗，12000 r/min，離心2 min，收集菌體。

1.3.1.3 PCR擴增

Primer 5.0軟件設計特異性引物PcesF/PcesR(PcesF):5′-ACCCATCTTGCGTCATT-3′(PcesR)：5′-CAGCCAAGTGAAGATACC-3′，對豆豉樣本中嘔吐毒素基因ces進行PCR擴增檢測。反應體系：2×Taq Master Mix 5.0 μL、Up-primer(PcesF, 10 μmol/L)0.5 μL、Down-primer(PcesR,10 μmol/L)0.5 μL、Template DNA 3.0 μL，ddH2O 1.0 μL。反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃終延伸6 min。PCR產物于2%瓊脂糖凝膠，100 V恒壓電泳30 min。

1.3.2 豆豉中嘔吐毒素cereulide含量的測定

1.3.2.1 樣品前處理

稱取自然發酵豆豉樣本、純種強化發酵豆豉樣本各1 g于15 mL離心管中。加入2 g無水Na2SO4和10 mL甲醇混勻，靜置30 min。70%功率超聲破碎10 min(超聲0.2 s，停1.0 s，振幅22%)后，3000 r/min離心10 min。吸上清液于新離心管中。剩下的沉淀繼續加入10 mL甲醇，重復超聲提取步驟。再吸取上清液并與之前提取的上清液合并。吸取20 mL提取液于真空濃縮機中凍干，用甲醇∶水溶液(80∶20，V/V)定容至400 μL。上述液體過0.2 μm濾膜后定容至400 μL，10000 r/min離心15 min，轉移上清至1 mL離心管中待測。

1.3.2.2 繪制標準曲線

取標準品貯備液用80%甲醇稀釋，準確配制(梯度稀釋)成濃度分別為0.010,0.10,0.50,1.0,5.0,30 μg/L的cereulide標準系列溶液。

1.3.2.3 色譜條件與質譜條件

參照參考文獻[19,20]。

1.3.2.4 回收率

向已知cereulide濃度樣品中添加4種不同濃度的標準溶液后，放置30 min使待測組分與樣品基體成分相互作用達到平衡，再將樣品前處理得到的樣品溶液在上述色譜和質譜條件中進行檢測。

2 結果與分析

2.1 豆豉樣本中ces基因檢測

由圖1可知，27個豆豉樣本(純種發酵9個、自然發酵豆豉樣本18個)中，純種發酵有8個豆豉樣本為陽性，檢出率為88.9%；自然發酵中，有18個豆豉樣本為陽性，檢出率為100%。嘔吐型BC的平均檢出率為96.3%。在CZ0h中未檢測出嘔吐型BC，原因可能是此時的豆豉樣本前發酵早期，嘔吐型BC菌數處于較少階段，導致提取的宏基因組濃度低于PCR檢測的最低檢測濃度，故無法進行檢測。

圖1 豆豉樣本中嘔吐毒素基因 ces 檢測Fig.1 Detection of cereulide gene ces in the fermented soya beans samples注：M為DL2000 Marker；泳道1為陰性對照；泳道2為陽性對照；泳道3～11為CZ0h、CZ6h、CZ1d、CZ2d、CZ3d、CZ4d、CZ5d、CZ6d、CZ7d；泳道12～29為ZR6h、ZR12h、ZR18h、ZR24h、ZR30h、ZR36h、ZR42h、ZR54h、ZR60h、ZR66h、ZR72h、ZR1d、ZR2d、ZR3d、ZR4d、ZR5d、ZR6d、ZR7d。

2.2 嘔吐毒素cereulide標準曲線繪制

采用UPLC-MS/MS分別檢測樣品空白(80%甲醇)、標準樣品(0.010，0.10，0.50，1.0，5.0，30 μg/L)，根據質譜定量信號計算相應濃度，結果見表1。

表1 標準曲線原始數據Table 1 The original data of standard curve

由圖2可知cereulide出峰時間約在3.3 min。

圖2 cereulide標準品LC-MS色譜圖Fig.2 The LC-MS chromatogram for cereulide standard sample

構建嘔吐毒素標準曲線方程，見圖3。標準曲線方程為Y=1.59e4+4.4Xe6，X表示嘔吐毒素cereulide濃度，Y表示響應值，相關系數(R2)>0.99，可見嘔吐毒素cereulide在0.10～30 μg/L范圍內呈良好的線性關系。

圖3 嘔吐毒素cereulide標準曲線Fig.3 The standard curve of emetic toxin cereulide

2.3 豆豉中嘔吐毒素cereulide含量檢測

根據1.3.2所述進行嘔吐毒素含量測定，首先對自然發酵成品豆豉和純種發酵成品豆豉中的cereulide進行提取，然后對其進行UPLC-MS定量檢測，結果見圖4和圖5。

圖4 純種強化發酵豆豉MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of pure fermented soya beans

圖5 自然發酵豆豉 MRM 譜圖Fig.5 MRM chromatogram of natural fermented soya beans

根據兩個樣本的質譜峰面積計算相應樣本濃度。樣本中蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素cereulide定量數據見表2。

表2 嘔吐毒素 cereulide 檢測Table 2 Detection of emetic toxin cereulide

由表2可知，自然發酵豆豉中嘔吐毒素cereulide含量約為(0.0106±0.0006) μg/kg，純種發酵豆豉中嘔吐毒素cereulide含量約為(0.0289±0.0002) μg/kg。純種強化發酵豆豉中嘔吐毒素cereulide含量高于自然發酵豆豉。但兩種方式發酵豆豉的嘔吐毒素cereulide都遠低于國標GB 2761-2017發酵豆制品中次生有毒代謝產物的限量安全標準5.0 μg/kg。從嘔吐毒素的含量上來看，目前該豆豉暫時不存在蠟樣芽孢桿菌產生的嘔吐毒素引發的食用安全性問題。

豆豉作為中國傳統的風味食品，其安全性受到人們的廣泛關注，對豆豉的安全性進行評價時，除了研究蠟樣芽孢桿菌數量外，還需對其產生的嘔吐毒素含量進行評價。目前，控制豆豉發酵過程中嘔吐型蠟樣芽孢桿菌的污染是一個急需解決的問題，因豆豉的后發酵是一個相對封閉的過程，難以實現在后發酵過程中控制嘔吐型蠟樣芽孢桿菌污染，所以前發酵和配料灌裝是控制嘔吐型蠟樣芽孢桿菌的污染源頭的關鍵之一。

2.4 嘔吐毒素cereulide加標回收率檢測

在豆豉樣品中添加不同濃度的嘔吐毒素標準溶液(見表3)，測定其加標回收率。

表3 加標回收率Table 3 The recovery rate of cereulide

由表3可知，加標回收率在81.9%～87.4%之間，可見該方法的回收率較好，準確性較高，能滿足檢測要求。

3 結論

本研究對豆豉樣品中嘔吐毒素ces基因進行PCR擴增，27個豆豉樣本中，26個豆豉樣本檢測為陽性，檢出率高達96.3%，該地區食品廠豆豉易出現嘔吐型蠟樣芽孢桿菌污染的情況。對樣本中嘔吐毒素進行定量檢測，自然發酵豆豉中含量達(0.0106±0.0006) μg/kg，純種發酵豆豉中含量達(0.0289±0.0002) μg/kg，均未超過國家標準，并且嘔吐毒素標準品在設定質量濃度范圍內線性良好(R2>0.99)，加標回收率在81.9%～ 87.4%之間，實驗重復性和儀器精密度較好。綜上所述，通過對該地區豆豉樣本進行嘔吐毒素定量分析，發現目前該地區食品廠生成的豆豉暫時不存在蠟樣芽孢桿菌產生的嘔吐毒素引發的食用安全性問題。本研究通過對不同發酵方式豆豉中嘔吐型蠟樣芽孢桿菌進行檢測，再對其中嘔吐毒素含量進行定量分析，對豆豉生產企業進行食品安全控制具有重要指導意義。