木糖對L-酪氨酸發酵的影響

李國華，熊海波，陳寧,2，徐慶陽,2*

(1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；2.代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津 300457)

酪氨酸是一種人體重要的芳香族氨基酸[1]，在食品、飼料、醫藥和化工等行業有廣泛應用[2]。它不僅可以調節情緒，刺激神經系統，還可幫助加快身體新陳代謝，治療慢性疲勞等。人體需要足夠的酪氨酸用以生產多種重要的大腦化學物質，以便于幫助調節食欲、疼痛敏感性和人體對壓力的反應。酪氨酸作為食品營養強化添加劑，已在乳制食品、肉制食品、烘焙食品、寵物罐頭、動物飼料等方面得到應用。

隨著大腸桿菌合成酪氨酸途徑的解析，利用代謝工程技術構建生產酪氨酸的重組大腸桿菌為研究的熱點[3-6]。前期的研究中[7]，本實驗室構建一株利用T7啟動子過表達aroGfbr和tyrAfbrtyrB基因的大腸桿菌，T7啟動子需要使用木糖誘導T7-RNA聚合酶的產生，使得T7啟動子控制關鍵基因的高效表達[8,9]。由于大腸桿菌木糖異構酶基因[10](xylA)的存在，在發酵過程中將會不斷消耗木糖[11]。本文從菌體生長、L-酪氨酸發酵、糖酸轉化率和代謝副產物等方面進行分析，最終選定木糖添加量30 g/L、隨流加葡萄糖一起流加木糖(木糖流加方式三)的方式為最佳方式。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 菌種

大腸桿菌TYR-05(PT7-aroGfbr+PT7-tyrAfbrtyrB+PxylF-T7RNAP+ΔpheLA)：由天津科技大學代謝工程研究室提供。

1.1.2 培養基

種子培養基：葡萄糖20 g/L，酵母粉[12]5 g/L，檸檬酸2 g/L，(NH4)2SO4·7H2O 2.8 mg/L，MgSO4·7H2O 9 g/L，VB13 mg/L，VH0.5 mg/L，115 ℃滅菌15 min。

發酵培養基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，檸檬酸2 g/L，(NH4)2SO44 g/L，K2HPO4·H2O 15 mg/L，MnSO4·7H2O 9 g/L， FeSO4·7H2O 2.5 mg/L， MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB11 mg/L，VH0.5 mg/L，115 ℃滅菌15 min。

1.1.3 儀器與設備

BT-457電子天平 深圳市博途電子科技有限公司；BIOTECH-5BG發酵罐 上海保興生物工程設備有限公司；Aglient 1200高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；SBA-40ES生物傳感分析儀 濟南延和生物科技有限公司；754PC紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；S-433D全自動氨基酸分析儀 賽卡姆(北京)科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

從-80 ℃冰箱中取出保菌管，于超凈臺上用移液器移取5 μL接種于裝有5 mL LB液體培養基的搖管中，200 r/min、36 ℃培養12～14 h后，取1 mL接種于LB固體培養基的茄形瓶中，并用接種環涂布均勻，32 ℃培養12～14 h。

1.2.2 種子擴培

用無菌水將大腸桿菌從培養至布滿菌苔的茄形瓶洗下，接種于2 L種子罐中，36 ℃培養6～8 h,取樣待OD600至12～14 h，按照10%的接種量接入裝液量為3 L的5 L發酵罐。

1.2.3 發酵

接種后36 ℃發酵開始，用質量分數為25%的氨水自動控制pH 為7.0，用質量分數為80%的葡萄糖流加控制發酵罐內葡萄糖濃度在2～5 g/L，調節攪拌轉速和通風流量，控制溶解氧在20%～40%的范圍內[13,14]。

圖1 木糖流加發酵L-酪氨酸結構示意圖Fig.1 Structural diagram of L-tyrosine fermentation by xylose fed-batch method

1.2.4 L-酪氨酸質量濃度的測定

發酵液預處理：發酵液用pH 10～12的NaOH溶液稀釋一定倍數后，0.45 μm膜過濾。

高效液相色譜測定：層析柱：Phenomenex C18 110A(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：1 mL/min的10%乙腈；溫度：30 ℃；檢測波長：230 nm，進樣量：20 μL。

1.2.5 乙酸質量濃度的測定

發酵液預處理：取發酵液1 mL于1.5 mL離心管中，13000 r/min離心3 min，上清液適當稀釋過膜備用。

高效液相色譜測定[15]：層析柱：Bio-Rad Aminex HPX-87 h(300 mm×7.8 mm，5 μm)；流動相：0.5 mL/min的0.005 mol/L H2SO4；溫度：30 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μL。

1.2.6 生物量的測定

采用濁度法，即在種子培養和發酵過程中取培養基樣品，用分光光度計測定600 nm的吸光值，樣品稀釋至0.2～0.8 g/L范圍內進行測定，生物量二稀釋后的吸光值×稀釋倍數。

1.2.7 微生物生長動力學和產物合成動力學公式

式中：X表示生物量；t表示時間；p表示產物濃度。

2 結果與討論

2.1 木糖添加量對重組大腸桿菌生物量和L-酪氨酸發酵的影響

在酪氨酸發酵0 h時，一次性向發酵罐中加入不同濃度的木糖，30 h后發酵結束，觀察其對重組大腸桿菌生物量和L-酪氨酸發酵的影響。在L-酪氨酸發酵過程中，木糖誘導T7-RNA聚合酶生成，控制T7啟動子高效表達關鍵基因生產L-酪氨酸時影響顯著，適量添加木糖可以有效地增加酪氨酸含量。

由圖2可知，較低濃度(≤30 g/L)的木糖不會顯著影響大腸桿菌的生物量，OD600為63；當木糖濃度超過30 g/L時，生物量降低了10%，說明過量的木糖會導致菌體代謝負擔較大，影響菌體生長。在發酵培養基中不添加木糖(木糖添加量為0 g/L)時，L-酪氨酸能力合成較弱，含量為1.57 g/L；隨著培養基中木糖濃度的增大，T7啟動子激活關鍵基因表達，L-酪氨酸合成途徑被強化，在發酵培養基中加入10 g/L的木糖時，L-酪氨酸含量為9.83 g/L，是不加木糖的6.26倍，影響顯著；在木糖添加量為30 g/L時，L-酪氨酸在發酵結束時含量為17.5 g/L，生物量OD600為65.4。繼續增加木糖濃度，L-酪氨酸濃度不再增加。

圖2 木糖添加量對大腸桿菌生物量和L-酪氨酸發酵的影響Fig.2 Effect of xylose additive amount on Escherichia coli biomass and L-tyrosine fermentation

發酵結束時，在木糖添加量少于30 g/L的發酵液中未檢測到木糖，木糖在發酵過程中被當作碳源逐漸消耗，導致木糖濃度下降，不能持續誘導T7啟動子，導致發酵產L-酪氨酸發酵水平低；然而當木糖添加量≥30 g/L時，發酵結束時仍能檢測到少量木糖，且L-酪氨酸濃度基本維持在17.5 g/L，木糖對T7啟動子誘導作用達到“飽和”?？紤]木糖成本的經濟性因素，30 g/L木糖添加量為最合適的濃度。

2.2 不同木糖流加方式對L-酪氨酸發酵的影響

在發酵過程前期，通過控制發酵條件提高生物量，可以縮短發酵周期。若木糖添加時間過晚，前期誘導表達不充分，產酸過慢，造成發酵產酸水平低。因此，木糖的添加量和添加時間對L-酪氨酸含量具有較大的影響。本研究選擇了3種木糖流加方式，探究不同流加方式對大腸桿菌生長和L-酪氨酸發酵的影響。

方式一：發酵0，10，20 h分別加入木糖30 g/L,共計90 g；

方式二：發酵0～20 h以1.5 g/(L·h)的速度恒速流加木糖，共計20 h×3 L×1.5 g/(L·h)=90 g；

方式三：木糖與流加葡萄糖同時流加，即90 g木糖和640 g葡萄糖定容至800 mL，流加進入發酵罐，木糖總量共計90 g。

由圖3可知，木糖的流加方式對大腸桿菌的生長和L-酪氨酸的發酵產生了重要影響。圖3(A和B)中，木糖流加方式三比方式一和方式二生長速率大，在發酵5 h達到最大生長速率7.43，最早到達穩定期，在發酵10 h時OD600為63。木糖流加方式三、方式二、方式一依次出現最大生長速度，并且最大生長速度遞減。可見，發酵液中流加誘導劑木糖對大腸桿菌的生長產生一定的抑制。

圖3 不同木糖流加方式對大腸桿菌生長和L-酪氨酸發酵的影響Fig.3 Effect of different xylose fed-batch methods on the growth of Escherichia coli and L-tyrosine fermentation注：A為生物量；B為生長速率;C為L-酪氨酸濃度;D為L-酪氨酸合成速率。

由圖3(C和D)可知，按照方式三流加木糖生產的L-酪氨酸含量高，發酵前期L-酪氨酸合成速率略低于方式一和方式二，在7.5 h左右方式三的合成速率接近并超過其他兩種方式，且在發酵15 h左右達到最大L-酪氨酸合成速率2.38 g/(L·h)，在30 h發酵結束時發酵罐內L-酪氨酸含量為33.5 g/L。這是由于按照方式三流加木糖，發酵過程前期大腸桿菌生物量較少，代謝葡萄糖速率較慢，只有消耗完發酵底糖后才會流加葡萄糖，造成隨流加糖流加的木糖在發酵液內濃度較低，對大腸桿菌的誘導作用不明顯；在發酵過程的中后期，按照方式三流加木糖的大腸桿菌優先到達平衡期且維持較大的生物量，又有流加木糖的積累效應，導致了L-酪氨酸合成速率的大幅增加，明顯超過了方式一和方式二，在30 h發酵結束時積累了33.5 g/L的L-酪氨酸。

由于木糖偶聯葡萄糖流加，有效地減少了菌體的代謝負擔和對菌體生長的抑制效應。本研究證實了方式三是一種有效的誘導生產L-酪氨酸方式。

2.3 不同木糖流加方式對糖酸轉化率和代謝副產物的影響

重組大腸桿菌在培養過程中往往會產生一定濃度的代謝副產物(尤其是乙酸)[16]，會對菌體生長、發酵產酸產生重要影響，最終會使糖酸轉化率降低，導致經濟效益下降[17]。研究發現，L-酪氨酸發酵液的代謝副產物主要是乙酸(HAc)、組氨酸(His)等。由圖5可知，采用方式三流加木糖誘導大腸桿菌生產L-酪氨酸在30 h發酵結束時乙酸含量最高達3.2 g/L，糖酸轉化率最高達17%，比方式一和方式二乙酸含量分別增加30%和60%，糖酸轉化率分別提高31%和75%；木糖流加方式一較方式二乙酸濃度高9.1%。在30 h發酵結束時，木糖流加方式二較方式一乙酸含量高，由于在發酵前期培養基中木糖含量較高，給菌體造成了較大的代謝負擔，葡萄糖快速代謝產生較多的代謝中間體，不能及時用于菌體生長和產物合成，碳源積累導致乙酰輔酶A轉化為乙酸[18]。

由圖4和圖5可知，木糖流加方式三乙酸含量過高與發酵初期細胞比生長速率和細胞攝氧速率有關[19]，在發酵前期，細胞攝氧速率隨細胞比生長速率升高，當細胞比生長速率達到一定數值之后，細胞攝氧速率不再升高，達到上限并成為限制因素，導致乙酸生成。結合圖3～圖5，隨著乙酸的積累，加速菌體衰老，菌體生長速率、產物合成速率、葡萄糖消耗速率和氨水消耗速率下降，縮短產物合成期，導致發酵提前結束。在以后的研究中，控制發酵前期適當的代謝壓力和細胞比生長速率，有助于抑制乙酸合成，延長產物合成期，防止細胞早衰。

圖4 木糖不同流加方式對比生長速率的影響Fig.4 Effect of different xylose fed-batch methods on specific growth rates

圖5 不同木糖流加方式對糖酸轉化率和代謝副產物的影響Fig.5 Effect of different xylose fed-batch methods on conversion rates of glucose and metabolic by-products

另外，采用木糖流加方式三較其他流加方式代謝副產物組氨酸、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、亮氨酸和精氨酸均有明顯減少，但是組氨酸相對含量較高，可能是木糖代謝強化了HMP途徑，引起組氨酸積累[20]。

3 結論

酪氨酸作為重要的食品營養強化添加劑，在治療抑郁癥、調節情緒、舒緩壓力等方面將日益受到廣泛關注和應用，微生物發酵法生產L-酪氨酸具有廣闊的前途。

研究結果表明，木糖作為誘導劑對L-酪氨酸發酵影響顯著，木糖添加量、木糖流加方式對菌體生長、產物合成、糖酸轉化率、代謝副產物等方面產生了重要影響。本文首先利用單因素實驗，得出30 g/L的木糖添加量為最適添加量，比不添加木糖的L-酪氨酸含量提高11.1倍；之后探究了不同木糖流加方式對L-酪氨酸發酵的影響，研究發現木糖流加方式三(木糖隨流加葡萄糖一起流加)最優：在30 h發酵結束時發酵罐內含量最高達33.5 g/L，糖酸轉化率最高達17%，乙酸濃度達3.2 g/L。比較方式一和方式二，酪氨酸含量分別提高91%和40%，糖酸轉化率分別提高55%和28%，但是乙酸濃度較高。