熱毒寧聯(lián)合甘草酸苷治療Ⅱ期手足口病及其免疫相關(guān)指標(biāo)的改變

黃勝賢，鄭利平，羅杰平，陳麗珍，黃盼柳，甘振釗，楊 蘭

(廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院暨南寧市第二人民醫(yī)院，廣西 南寧 530031)

手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)是腸道病毒引起的發(fā)熱、手足口臀部位皰疹的急性傳染病，主要由腸道病毒71型(EV71)、A 組柯薩奇病毒(Cox A)和?？?Echo)病毒引起。大部分HFMD患兒可自限，預(yù)后良好，而部分患兒卻病情嚴(yán)重，繼發(fā)嚴(yán)重后遺癥甚至危及生命[1]。導(dǎo)致HFMD 轉(zhuǎn)歸懸殊的因素不僅與患兒所感染的病毒類別、患兒免疫功能相關(guān)，而且與及時(shí)有效的治療密切相關(guān)。因此，本研究旨在探討具有免疫調(diào)節(jié)作用的熱毒寧及甘草酸苷聯(lián)合干預(yù)下，Ⅱ期HFMD患兒的治療成效及免疫功能的變化，以期為臨床研究HFMD的藥物治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象：將2017年1月～2019年10月在南寧市第二人民醫(yī)院診療的286例Ⅱ期HFMD患兒隨機(jī)分為四組，其中，熱毒寧組：男39例，女34例，年齡7～76個(gè)月，平均年齡36.9個(gè)月；甘草酸苷組：男39例，女33例，年齡6～81個(gè)月，平均年齡34.3個(gè)月；聯(lián)合用藥組：男42例，女33例，年齡6～84個(gè)月，平均年齡35.7個(gè)月；常規(guī)用藥組：男37例，女29例，年齡5～77個(gè)月，平均年齡34.4個(gè)月。同時(shí)選取在醫(yī)院體檢中心進(jìn)行健康體檢的健康兒童 63例作為對(duì)照組，男35例，女28例，年齡10～81個(gè)月，平均年齡38.3個(gè)月。5組研究對(duì)象在年齡和性別上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。

Ⅱ期HFMD患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照《腸道病毒 71 型(EV71)感染重癥病例臨床救治專家共識(shí)(2011 版)》[2]明確診斷的Ⅱ期HFMD患兒；②出現(xiàn)發(fā)熱，患兒的手、足、臀有皰疹、斑丘疹，周圍有炎性紅暈，同時(shí)伴有咳嗽、流涕、食欲不振等癥狀；③口腔潰瘍較手、足、臀部皰疹出現(xiàn)時(shí)間早；④血常規(guī)檢測(cè)白細(xì)胞正?；蚵杂猩?；⑤征得患兒監(jiān)護(hù)人同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①藥物過敏；②合并有其他心、肺、腦等疾??；③有嚴(yán)重細(xì)菌感染；④合并感染濕疹、水痘或口蹄疫等疾??；⑤伴有嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良、血液病者；⑥依從性差或者中途退出研究者。本研究經(jīng)我醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2治療方案：常規(guī)用藥組進(jìn)行常規(guī)方法治療，包括退熱，口腔疼痛局部對(duì)癥治療，抗病毒治療，維持水電解質(zhì)及酸堿平衡；熱毒寧組在常規(guī)用藥組基礎(chǔ)上給予熱毒寧輸注。按照0.6～0.8 ml/kg輸注熱毒寧注射液(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司)，1次/d，連用5 d；甘草酸苷組常規(guī)用藥組基礎(chǔ)上給予甘草酸苷治療：口服復(fù)方甘草酸苷片(中國(guó)衛(wèi)材藥業(yè)有限公司)50 mg/次，1次/d，連用5 d；聯(lián)合用藥組在甘草酸苷組的基礎(chǔ)上給予熱毒寧治療，1次/d，連用5 d。

1.3實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.3.1標(biāo)本采集：抽取治療5 d后的空腹靜脈血約5 ml，分別注入干燥管和 EDTA-K2抗凝管中。干燥管靜置30 min后，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min，分離血清用于測(cè)定免疫球蛋白 lgG、IgM、IgA水平。EDTA-K2抗凝管充分混勻，用于T淋巴細(xì)胞、Th 細(xì)胞、Tc 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞百分比的測(cè)定。

1.3.2主要儀器和試劑：BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，特定蛋白分析儀(德國(guó)西門子公司)，lgG、IgM、IgA試劑(德國(guó)西門子公司)；T 淋巴細(xì)胞、Th 細(xì)胞、Tc 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè)試劑(美國(guó)BD公司)。

1.3.3免疫球蛋白lgG、IgM、IgA的檢測(cè)：按照特定蛋白分析儀及相關(guān)試劑盒說明書檢測(cè)研究對(duì)象外周血清中免疫球蛋白lgG、IgM、IgA的水平。

1.3.4T淋巴細(xì)胞、Th 細(xì)胞、Tc 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞百分比的測(cè)定：按照流式細(xì)胞儀及相關(guān)試劑盒說明書檢測(cè)所有研究對(duì)象 T 淋巴細(xì)胞(CD3+)、Th 細(xì)胞(CD3+CD4+)、Tc 細(xì)胞(CD3+CD8+)、NK 細(xì)胞(CD16+CD56+)和 B 淋巴細(xì)胞(CD19+)在外周血中的數(shù)量及其所占淋巴細(xì)胞的百分比。

1.4觀察指標(biāo)及評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床療效觀察:①退熱時(shí)間：包括退熱起效時(shí)間(HFMD患兒治療后，肛溫下降0.5 ℃所需時(shí)間)及恢復(fù)正常體溫時(shí)間(治療后HFMD患兒肛溫≤37.5 ℃，且持續(xù)24 h以上)。②皮疹消失時(shí)間：無新皮疹出現(xiàn)，且原有皮疹結(jié)痂或脫落所需時(shí)間。③危重轉(zhuǎn)化率情況；從Ⅱ期轉(zhuǎn)為危重型的HFMD患兒比例。④精神狀態(tài)恢復(fù)情況、驚顫消失時(shí)間。(2)療效標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)用藥5 d后觀察治療效果。治愈：體溫正常，皮疹消退，精神好，無驚顫等精神受累癥狀；有效：體溫正常，皮疹減少，精神好轉(zhuǎn)，驚顫次數(shù)減少；無效：反復(fù)發(fā)熱，皮疹無變化，頻繁驚顫，意識(shí)障礙加重等。總有效率=(治愈+有效)÷總例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1Ⅱ期HFMD患兒臨床療效觀察指標(biāo)比較：4組Ⅱ期HFMD患兒的退熱起效時(shí)間、體溫恢復(fù)正常時(shí)間、皮疹消失時(shí)間、精神狀態(tài)恢復(fù)或驚顫消失時(shí)間及臨床療效差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步組間比較，熱毒寧組、甘草酸苷組和聯(lián)合用藥組的上述指標(biāo)較常規(guī)用藥組有顯著差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合用藥組的危重轉(zhuǎn)化率較常規(guī)用藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.640，P=0.018)。熱毒寧組、甘草酸苷組和聯(lián)合用藥組兩兩比較，體溫恢復(fù)正常時(shí)間、皮疹消失時(shí)間、精神狀態(tài)恢復(fù)或驚顫消失時(shí)間有明顯差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，加重轉(zhuǎn)化率及療效觀察略有差異，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。甘草酸苷組的退熱起效時(shí)間雖略高于熱毒寧組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.094)。見表1、表2。

表1 Ⅱ期HFMD患兒臨床觀察指標(biāo)比較

表2 Ⅱ期HFMD患兒臨床療效比較[例(%)]

2.2Ⅱ期HFMD組與對(duì)照組的免疫細(xì)胞及免疫球蛋白的結(jié)果比較：較對(duì)照組，Ⅱ期HFMD患兒組的T 淋巴細(xì)胞(CD3+)及Th 細(xì)胞(CD3+CD4+)的百分比、Th 細(xì)胞/Tc 細(xì)胞比值和 免疫球蛋白的lgG、IgA水平顯著降低，B淋巴細(xì)胞百分比和IgM明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。Tc細(xì)胞百分比較對(duì)照組略降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 Ⅱ期HFMD患兒與對(duì)照組的免疫細(xì)胞及免疫球蛋白的結(jié)果

2.3Ⅱ期HFMD患兒外周血中T 淋巴細(xì)胞(CD3+)、Th 細(xì)胞(CD3+CD4+)、Tc 細(xì)胞(CD3+CD8+)、NK 細(xì)胞(CD16+CD56+)和 B 淋巴細(xì)胞(CD19+)的檢測(cè)結(jié)果：Ⅱ期HFMD患兒4組間的外周血T 淋巴細(xì)胞(CD3+)、Th 細(xì)胞(CD3+CD4+)、Th 細(xì)胞/Tc 細(xì)胞比值 和 B 淋巴細(xì)胞(CD19+)的百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步組間比較，熱毒寧組、甘草酸苷組和聯(lián)合用藥組的T 淋巴細(xì)胞(CD3+)、Th 細(xì)胞(CD3+CD4+)、Th 細(xì)胞/Tc 細(xì)胞比值 和 B 淋巴細(xì)胞的百分比較常規(guī)用藥組有顯著差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合用藥組的Th 細(xì)胞百分比、Th 細(xì)胞/Tc 細(xì)胞比值，高于熱毒寧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027；P=0.019)，雖略高于甘草酸苷組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.094；P=0.073)。熱毒寧組的B淋巴細(xì)胞百分比明顯高于甘草酸苷組和聯(lián)合用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024；P=0.013)，見表4。

表4 Ⅱ期HFMD患兒免疫細(xì)胞測(cè)定結(jié)果

2.4Ⅱ期HFMD患兒外周血中免疫球蛋白lgG、IgM、IgA的檢測(cè)結(jié)果：Ⅱ期HFMD患兒4組間的外周血免疫球蛋白lgG、IgM、IgA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組間進(jìn)一步比較，熱毒寧組、甘草酸苷組和聯(lián)合用藥組的免疫球蛋白lgG、IgM、IgA較常規(guī)用藥組有顯著差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合用藥組的lgG、IgA水平高于熱毒寧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027；P=0.019)，免疫球蛋白 IgM 水平較熱毒寧組稍有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清中IgM水平與外周血中B淋巴細(xì)胞百分比呈正相關(guān)(r=0.841,P=0.018)。

圖1 免疫細(xì)胞分析結(jié)果圖

表5 Ⅱ期HFMD患兒四組外周血中免疫球蛋白的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前，HFMD治療尚無特效藥，Ⅱ期及以上重癥患兒的治療，主要在身體各臟器全面檢查的基礎(chǔ)上實(shí)施綜合性的藥物對(duì)癥治療。有研究表明重癥HFMD的發(fā)生與病毒的直接損傷和免疫紊亂導(dǎo)致機(jī)體損傷密切相關(guān)[3-4]。因此抗病毒及糾正免疫功能紊亂是治療重型HFMD的主要措施。熱毒寧是由金銀花、青蒿和梔子提取精制而成的中藥注射液，具有清熱、解毒、疏風(fēng)功效。有研究提示熱毒寧具有退熱、抗病毒、抗感染及提高免疫力的作用[5]，體外藥理研究也證實(shí)熱毒寧能夠?qū)笴ox A及 EV71型病毒[6]。甘草酸苷是甘草的主要活性成分，具有抗感染、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。尹翠紅等研究表明消化道內(nèi)的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶可將甘草酸苷水解為18β-甘草次酸和葡萄糖醛酸[7]。具有類皮質(zhì)醇樣結(jié)構(gòu)的18β-甘草次酸，可通過抑制11β-羥基固醇脫氫酶的活性發(fā)揮皮質(zhì)醇的作用[8-9]。熱毒寧注射液臨床使用常與抗菌藥物、抗病毒藥物、糖皮質(zhì)激素腎上腺素、注射用鹽酸氨溴索等聯(lián)用，可提高療效、縮短病程。因此，本研究欲探討熱毒寧與具有類皮質(zhì)醇作用的甘草酸苷聯(lián)用對(duì)Ⅱ期HFMD患兒的免疫功能的影響及療效。

本研究結(jié)果顯示，較常規(guī)用藥組，熱毒寧、甘草酸苷治療的Ⅱ期HFMD患兒熱退時(shí)間、皮疹消退時(shí)間、精神狀態(tài)恢復(fù)或驚顫消失時(shí)間明顯縮短，提示熱毒寧、甘草酸苷療效優(yōu)于常規(guī)用藥組，而熱毒寧聯(lián)合甘草酸苷較單用熱毒寧、甘草酸苷的熱退時(shí)間、皮疹消退時(shí)間、精神狀態(tài)恢復(fù)或驚顫消失時(shí)間顯著下降，說明熱毒寧聯(lián)用甘草酸苷在治療Ⅱ期HFMD有顯著的療效。熱毒寧聯(lián)合甘草酸苷治療患兒危重型轉(zhuǎn)化率明顯低于常規(guī)用藥組，體現(xiàn)了熱毒寧聯(lián)用甘草酸苷可降低危重癥轉(zhuǎn)化率。較正常健康兒童，Ⅱ期HFMD患兒的免疫細(xì)胞T 淋巴細(xì)胞、Th 細(xì)胞百分比及Th 細(xì)胞/Tc 細(xì)胞比值明顯降低，B 淋巴細(xì)胞百分比顯著升高。這與王潔等認(rèn)為感染EV71病毒后機(jī)體淋巴細(xì)胞將處于低水平狀態(tài)，B淋巴細(xì)胞處于活化增殖狀態(tài)的結(jié)論一致[10]。機(jī)體感染EV71后通過多種途徑引起 T 細(xì)胞凋亡或抑制其增殖，從而引起細(xì)胞免疫和固有免疫紊亂。當(dāng)細(xì)胞免疫功能低下不能有效殺滅或抑制病毒時(shí)，機(jī)體會(huì)通過活化 B 細(xì)胞、成漿細(xì)胞分泌大量抗體，積極調(diào)動(dòng)體液免疫來參與抗病毒過程[10]。但Ⅱ期HFMD患兒IgA、IgG 水平較健康兒童明顯降低，IgM 水平升高，分析原因可能是EV71病毒感染后，增加了免疫球蛋白的消耗，同時(shí)早期體液免疫應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)生大量IgM，導(dǎo)致免疫球蛋白間趨勢(shì)不一致的情況。本研究中 Ⅱ期HFMD患兒 NK 細(xì)胞較正常兒童低，這與其他報(bào)道中 NK 細(xì)胞偏低結(jié)論一致[11-12]，HFMD患兒重癥化后NK細(xì)胞可能耗竭或功能障礙狀態(tài),導(dǎo)致NK細(xì)胞水平偏低。單獨(dú)或聯(lián)合使用熱毒寧、甘草酸苷的Ⅱ期HFMD患兒的T 淋巴細(xì)胞(CD3+)、Th 細(xì)胞(CD3+CD4+)、NK 細(xì)胞(CD16+CD56+)百分比及Th 細(xì)胞/Tc 細(xì)胞比值較常規(guī)用藥組明顯升高，B 淋巴細(xì)胞(CD19+)百分比及免疫球蛋白IgM顯著降低，提示熱毒寧、甘草酸苷能顯著地改善Ⅱ期HFMD患兒的細(xì)胞免疫功能紊亂情況，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，通過多種途徑間接抑制B細(xì)胞的活化增殖及IgM抗體的水平。聯(lián)合用藥組僅Th 細(xì)胞百分比及Th 細(xì)胞/Tc 細(xì)胞比值較熱毒寧組顯著升高，較甘草酸苷組略升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這與本研究的預(yù)期設(shè)想：熱毒寧聯(lián)合甘草酸苷在治療Ⅱ期HFMD患兒上較單獨(dú)用藥會(huì)產(chǎn)生疊加的治療效果不一致，分析原因可能是：①熱毒寧和甘草酸苷都通過多途徑調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，二者的免疫調(diào)節(jié)途徑可能有部分相同，兩種藥物競(jìng)爭(zhēng)同樣的藥物受體，因此免疫調(diào)節(jié)的作用被弱化；②熱毒寧聯(lián)合甘草酸苷對(duì)Ⅱ期HFMD患兒確有疊加作用(前面所述聯(lián)合用藥組較單用熱毒寧或甘草酸苷組的臨床療效佳)，但免疫功能的影響因素有病原體、遺傳、機(jī)體自身等諸多因素，加上本研究納入研究對(duì)象選取上具有局限性，不足以檢測(cè)出聯(lián)合用藥在免疫功能的疊加作用。聯(lián)合用藥組較單用熱毒寧或甘草酸苷Ⅱ期HFMD患兒的T 淋巴細(xì)胞(CD3+)、Th 細(xì)胞(CD3+CD4+)、NK 細(xì)胞(CD16+CD56+)百分比及Th 細(xì)胞/Tc 細(xì)胞比值升高，雖他們之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但增加研究例數(shù)可能會(huì)驗(yàn)證這一結(jié)論。

總之，熱毒寧、甘草酸苷能有效地改善Ⅱ期HFMD患兒臨床癥狀和免疫功能紊亂，取得較好的治療效果。然而，熱毒寧聯(lián)合甘草酸苷治療HFMD患兒較單獨(dú)用藥是否有疊加作用仍需后續(xù)深入研究加以論證。