氣體信號分子硫化氫下調CTGF途徑在改善小鼠酒精性腎間質纖維化中的應用

張愛民，劉佳麗，向長鐵，劉茂軍，吳 倩，陳 堅，聶連桂，張晶晶，楊 軍

(南華大學附屬第一醫院心內科，湖南 衡陽 421001)

在酒文化歷史悠久的中國，隨著社會發展、經濟水平的提高，新型行業的崛起，飲酒已成為聚會、應酬不可或缺的一部分。過量飲酒會導致多臟器功能損害，現已成為當今世界范圍內的重要公共衛生問題之一[1]。肝臟作為乙醇代謝及易受損傷的主要器官之一，其相關機制已有較深入探索[2-4]，而隨著對酒精性相關疾病研究的深入，腎臟作為僅次于肝臟的乙醇排泄器官，發現乙醇對腎臟也有明顯損傷作用，但相關研究尚少見報道。腎間質纖維化是指各種原發性、繼發性腎損害發展至終末期的共同通路[5-7]，抑制腎纖維化的發展有助于延緩腎功能減退。酒精性腎損傷作為腎間質纖維化原因之一，探討酒精性腎損傷所致腎間質纖維化相關作用機制對延緩腎間質纖維化的進展和指導治療具有重要意義。MMPs/TIMPs失調是引起腎間質纖維化細胞外基質集聚的重要調控機制[8]。結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)也被認為是導致膠原重構的一個重要介質，其異常表達在腎間質纖維化進程中也起著至關重要作用[9]。目前已有研究表明，H2S能延緩慢性腎臟病發展，參與肝、腎、心等多器官纖維化，但對酒精性腎間質纖維化的作用機制尚缺乏足夠的研究[10-11]。因此，本實驗擬通過飲用乙醇水溶液建立慢性酒精性腎損害小鼠模型，觀察H2S對小鼠酒精性腎間質纖維化及MMP-8、TIMP-1與CTGF蛋白表達水平的影響以及在酒精性腎間質纖維化的潛在治療及機制。

1 資料與方法

1.1實驗材料：40只成年體健雄性昆明小鼠，購自南華大學動物實驗中心；實驗小鼠分別單籠飼養于室內，溫度約為(24±3)℃，按時消毒；小鼠可以自由獲得水和食物。硫氫化鈉(H2S)供體、內源性H2S生成酶抑制劑炔丙基甘氨酸(PAG)購于美國 Sigma 公司；兔一抗MMP-8、TIMP-1、CTGF、GAPDH購于中國博士德公司；兔二抗購于美國Proteintech公司；BCA蛋白定量試劑盒購于中國博士德公司；細胞裂解液購于碧云天公司。

1.2實驗方法：酒精性腎損傷小鼠模型制備及分組：將40只成年體健雄性昆明小鼠在上述環境中適應性喂養1周,已排除外界干擾因素對實驗結果的影響。之后將小鼠隨機分為對照組(Control組)、酒精性腎損傷組(ARD組)、硫化氫干預組(H2S組)、內源性H2S生成酶抑制劑炔丙基甘氨酸組(PAG組)，每組各10只。除Control組外，其他各組小鼠在標準飼料喂養的基礎上，每日飲用4%的乙醇水溶液12周以構建酒精性腎損傷模型(4%的乙醇水溶液是ARD組、H2S組及PAG組小鼠的唯一飲用水源)，每天早晨更換4%乙醇一次；Control組小鼠則每天飲用清水。另外，H2S組小鼠每天腹腔注射NaSH(50μmol/kg)，PAG組小鼠每天腹腔注射PAG(40 mg/kg)，Control組和ARD組小鼠則每天腹腔注射等劑量生理鹽水。根據組織病理形態學結果評價造模是否成功。

1.3觀察指標

1.3.1PAS染色觀察腎臟組織形態學改變：取腎臟組織, 投入固定液內固定脫水、透明、浸蠟、包埋。常規切片,脫蠟至水，蒸餾水沖洗，70%乙醇沖洗。浸入高碘酸酒精溶液10 min，70%乙醇沖洗后入還原液中1 min，70%乙醇沖洗后入無色鹽基性品紅溶液1 h，流水沖洗10 min，用哈瑞蘇木精復染細胞核3 min后，再用1%的鹽酸酒精分化，流水沖洗5 min，常規脫水、透明、封固。200倍光鏡下觀察小鼠腎臟組織形態學改變。

1.3.2Masson染色觀察腎臟組織間質纖維化程度：取小鼠腎臟組織，以100 g/L多聚甲醛固定后，取甲醛固定的腎臟組織；石蠟包埋,切片5 μm；切片脫蠟,入5%鐵明礬水溶液24 h；蒸餾水洗,用Regaud鐵木素染24 h；蒸餾水洗,入2.5%鐵明礬水溶液,至細胞核清晰顯出；自來水洗10 min；入1%冰醋酸配制的1%酸性復紅5 min；蒸餾水洗,加入磷鉬酸水溶液脫色；加入含2.5%冰醋酸苯胺藍飽和水溶液染5 min；蒸餾水洗,入1%冰醋酸水脫去過多的苯胺藍及磷鉬酸；入0.1%冰醋酸的無水酒精；用無水酒精脫水,二甲苯透明,封固。200倍光鏡下觀察小鼠腎臟組織間質纖維化程度。

1.3.3Western Blot檢測MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白的表達水平：取各組小鼠新鮮腎臟組織研磨提取蛋白，采用BCA比色法進行蛋白定量；配置10% SDS-PAGE分離膠電泳分離蛋白，蛋白樣品在100℃煮沸5 min，每孔20 μl蛋白樣品上樣，將膠置于電泳緩沖液中電泳用以分離目的蛋白，后將目的條帶切下，以10 V半干式電轉膜30 min將蛋白質轉移至PVDF膜上。用TBST配制的5% BSA封閉2 h，封閉后以MMP-8、TIMP-1和CTGF為一抗(稀釋度為 1∶500)、GAPDH為內參37 ℃孵育1 h 后 4 ℃冰箱過夜；經TBST洗膜后，用HRP標記的羊抗兔二抗(稀釋度為1∶8 000)在37 ℃溫度下孵育1 h，用TBST洗膜，ECL顯色，曝光后掃描，用 Image J 圖像分析軟件進行光密度分析。

2 結果

2.1大鼠存活情況：12周后，共存活35只大鼠，其中ARD組、H2S組、PAG組分別有2 只、1 只、2 只大鼠死亡。

2.2各組小鼠腎臟免疫組化結果的比較

2.2.1PAS染色：光鏡下可見ARD組與Control組相比，腎臟纖維排列明顯紊亂，腎小球、腎小管、腎間質腫脹，腎小管退行性改變及系膜基質增多；而H2S組與ARD組相比，腎臟纖維排列明顯改善，間質有少量疏松結締組織，系膜基質減少。PAG組小鼠腎臟組織結構和纖維排列與ARD組類似。見圖1。

A：Control組；B：ARD組；C：H2S組；D：PAG組

2.2.2Masson染色：與Control組相比，ARD組可見明顯腎小管間質纖維化；與ARD組相比，H2S組腎小管間質纖維化明顯改善；PAG組小鼠腎小管間質纖維化程度與ARD組無明顯差異。見圖2。

A：Control組；B：ARD組；C：H2S組；D：PAG組

2.3硫化氫降低酒精性腎損傷大鼠腎臟組織中MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白的表達：取Control組、ARD組、H2S組和PAG組的腎臟組織，用Western blot法檢測各組蛋白MMP-8、TIMP-1和CTGF表達水平。結果：與Control組相比，ARD組小鼠腎臟組織中MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與ARD組相比，H2S組小鼠腎臟MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白表達減少，差異有統計學意義(P<0.05)；PAG組與ARD組比較，MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。提示硫化氫干預可抑制酒精性腎損害小鼠腎臟組織中MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白表達的上調。見圖3。

圖3 各組小鼠腎臟組織中MMP-8、TIMP-1和CTGF的蛋白表達水平(*:P<0.05,與control組比較；#：P<0.05，與ARD組比較)

3 討論

機體長期攝入大量酒精后可導致多臟器功能損害，目前也有眾多酒精性肝損傷及其防治方面的研究報道，但對酒精引起的腎損傷尚未引起足夠重視。有研究提示酒精性腎損傷機制可能與乙醇在體內代謝過程中氧化應激、炎性反應損傷、毒性代謝產物蓄積、誘導多種細胞生長因子產生等直接或間接損害腎小球及腎間質最終引起腎間質纖維化有關[12]，其中以機體在各種生長因子共同作用下不斷刺激成纖維細胞過度增殖活化，持續分泌不易降解的膠原蛋白，引起合成和降解失衡，造成細胞外基質(Extracellularma-trix, ECM)異常沉積，損傷腎小管，引起腎間質纖維化為主要特征，但具體調控機制尚不明確。

腎間質纖維化嚴重程度與腎功能不全具有明確相關性，是引起酒精性腎功能衰竭的重要病理機制，間質成纖維細胞增殖、細胞外基質沉積、白細胞滲入、腎小管細胞凋亡和壞死等為其重要病理特征。MMPs是一類高度保守的依賴性內肽酶，是降解細胞外基質成分的主要酶系，可選擇性地分解ECM的各種成分[13]。MMP-8主要由嗜中性粒細胞合成，亦稱嗜中性粒細胞膠原酶，是一種專門降解細胞外基質成分的酶，既參與炎性反應刺激，還可通過增加I型膠原蛋白水解酶活性從而降解細胞外基質參與組織重塑[14]。TIMPs 是 MMPs 的內源性特異性抑制劑，TIMP-1參與心、腎重塑調節并作為心腎功能衰竭的標志物。當 MMPs/TIMPs調節異常時，細胞外基質合成增加、降解減少引起的基質沉積在腎間質纖維化的發生、發展中具有重要作用[8]。CTGF是一類新發現的細胞生長因子，廣泛存在于人類組織中，尤以腎組織含量最多，被認為是導致膠原纖維重構的重要介質，參與腎臟、肝臟、肺等多臟器的纖維化過程，其機制可能與CTGF通過自身促進成纖維細胞有絲分裂、增殖、趨化性和黏附或者聯合其他細胞因子調控腎系膜細胞的分化、細胞外間質合成與降解參與腎間質纖維化的發病過程[15-16]。CTGF還能直接誘導TIMP-1參與組織修復和重塑[17]。本研究發現，酒精性腎損傷小鼠出現明顯腎小管間質纖維化，且CTGF、MMP-8表達水平明顯上調，其抑制劑TIMP-1表達水平也代償性上調，提示腎間質纖維化可能與CTGF信號通路及其調控的MMP-8/TIMP-1失調有關。

H2S是一種具有廣泛生理功能的新型氣體信號分子，由半胱氨酸通過光硫醚γ-裂解酶(GCL)和胱硫醚β-合酶(CBS)合成。目前多研究表明，H2S可通過抗氧化應激、抗炎、抑制細胞凋亡等對心血管系統起保護作用[18]。也有研究表明H2S具有增加腎血流量、腎小球濾過率和抑制蛋白尿等作用，還能防止足細胞損傷，保持腎小球結構的完整性等，從而對腎臟發揮保護作用[19]。本試驗成功構建酒精性腎損傷小鼠模型，表明H2S干預可明顯改善酒精性腎損害小鼠腎間質纖維化，同時腎臟組織中MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白的表達也顯著下調，提示H2S可能通過下調CTGF信號通路及其調控的MMP-8/TIMP-1失調而抑制腎間質成纖維細胞的激活、增殖，減少細胞生長因子生成發揮抗纖維化作用，因此，抑制CTGF、MMP-8、TIMP-1表達對延緩酒精性腎損害所致腎間質纖維化有重要作用。