紅肉火龍果 TST基因家族的生物信息學分析

鄭乾明， 王小柯， 馬玉華

(貴州省農業科學院 果樹科學研究所， 貴州 貴陽 550006)

火龍果是仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereus)多年生果樹，其果實色澤鮮艷、營養豐富，深受消費者歡迎。研究表明，成熟火龍果果實積累的可溶性糖主要是葡萄糖和果糖，蔗糖含量較低[1-2]。可溶性糖含量和構成是決定火龍果果實品質和商品價值的關鍵因子。研究火龍果果實的可溶性糖積累，對調控和改良果實品質，提高果品價值具有重要意義。當前對火龍果果實可溶性糖積累的分子機制尚無研究，參與可溶性糖積累的功能基因未見分離。

液泡是植物細胞中可溶性糖的主要貯藏場所，液泡膜上的糖轉運蛋白參與可溶性糖的跨膜輸入或輸出，從而影響液泡乃至整個細胞可溶性糖的積累[3-4]。植物TST基因家族是近年逐步證明其糖轉運特性和參與可溶性糖積累的糖轉運蛋白。TST蛋白定位于液泡膜，通過偶聯質子的方式反向轉運蔗糖、葡萄糖或果糖，因而是一個負責糖輸入的糖轉運蛋白[5-7]。目前在蘋果、葡萄、甜橙、梨和森林草莓基因組序列中克隆獲得TST基因家族，其表達模式與果實可溶性糖積累密切相關[8-12]。西瓜、甜瓜和梨相關TST基因在草莓或番茄果實中過表達，均證明其促進果實可溶性糖積累，是控制果實可溶性糖含量的重要正調控基因[13-15]。

目前尚無火龍果基因組序列發布，前期針對火龍果果實和莖進行多次轉錄組測序，獲得的序列數據可用于目的基因分離[16]。研究對火龍果果實和莖轉錄組測序獲得的Unigene進行分析，分離TST基因家族并進行生物信息學分析，為研究火龍果TST基因的生理功能，探討果實可溶性糖積累的分子機制，調控和改良果實品質奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 轉錄組數據來源

研究從以下數據中篩選目的基因：2015年11月采集火龍果成熟果實和成熟莖樣品轉錄組測序，獲得Unigene數據量為55.0 Mb，Unigene數量79 658個[16]。2017年9-10月采集5個時期火龍果果實共15份樣品轉錄組測序，獲得Unigene數據量為84.7 Mb，Unigene數量為63 958條。2018年9月采集火龍果成熟果實和成熟莖共6份樣品轉錄組測序，獲得Unigene數據量為58.8 Mb，Unigene數量為6 6253條。

1.2 火龍果 TST基因分離

從上述轉錄組測序獲得的序列注釋結果中檢索tonoplast sugar transporters、tonoplast monosaccharide transporters或monosaccharide-sensing protein相關的Unigene序列，使用BioEdit程序進行序列拼接，獲得的一致性Contig序列用Blastx程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)再次檢索。

1.3 序列分析

開放讀碼框(Open reading frame，ORF)預測使用ORF Finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)，相對分子量和理論等電點預測使用在線Protparam程序(https://web.expasy.org/compute_pi/)；HMMTOP程序(http://www.enzim.hu/hmmtop/index.php)；亞細胞定位預測使用WoLF PSORT程序(網站中的Conserved Domain Database(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)。

1.4 系統發育分析

從GenBank數據庫下載擬南芥AtTMT1-3家族(At1g20840、At4g35300和At3g51490)、葡萄VvTMT1-3家族(HQ323282、HQ323283和HQ323284)、西瓜ClTST1-3家族(KY367354、KY367352和KY367355)、甜瓜CmTST1-3(XP_008464819.1、XP_008448165.1和XP_016899284.1)和甜菜TST家族(BvTST1：XP_010686712.1、BvTST2.1：XP_010678631.1、BvTST2.2：XP_010690557.1、BvTST3：XP_010680636.1)等序列。從薔薇科果樹基因組數據庫(https://www.rosaceae.org/)下載蘋果TST家族序列(MdTMT1-3：MDP0000381084、MDP0000212510和MDP000086

8028)，使用Clustal W程序進行氨基酸序列比對，比對結果利用MEGA7.0，采用鄰接法構建系統發育樹，Bootstrap值進行1 000次重復檢驗。

2 結果與分析

2.1 TST基因家族分離

根據此前對火龍果果實和莖組織3次轉錄組測序獲得的Unigene注釋結果，結合序列比較、拼接和注釋，共獲得4條火龍果TST相關序列(表1)。根據NCBI網站中序列同源性比對結果，命名為HpTST1、HpTST2.1、HpTST2.2和HpTST3，分別含有長度為2 127 bp、2 235 bp、2 220 bp和2 193 bp的ORF，編碼長度分別為708 aa、744 aa、739 aa和730 aa的氨基酸序列。其預測等電點為4.84～5.36，相對分子量為75.7～80.4 kDa。

表1 紅肉火龍果 TST基因家族成員信息

2.2 序列同源性

紅肉火龍果TST基因家族序列進行兩兩比較結果表明，HpTST2.1和HpTST2.2間的核苷酸和氨基酸序列相似性較高，分別為80.6%和80.5%；其余兩兩間核苷酸和氨基酸序列相似性分別為67.3%～68.8%和64.7～67.8%。從表2可知，HpTST1與甜菜TST1、菠菜TST2氨基酸序列相似性分別為78.0%和74.9%；HpTST2.1與甜菜TST2.2、TST2.1氨基酸序列相似性分別為79.5%和76.9%；HpTST2.2與甜菜TST2.2、TST2.1氨基酸序列相似性分別為80.0%和76.0%；HpTST3與甜菜TST3、藜麥TST2氨基酸序列相似性分別為83.4%和82.0%。

表2 紅肉火龍果 TST基因氨基酸與其他相關基因的序列相似性

TST氨基酸序列保守結構預測表明，紅肉火龍果TST基因的氨基酸序列N端均含有MFS超家族(Major Facilitator Superfamily，主要易化子超家族)結構域(編號：cl28910)，在C端含有MFS家族GLUT(Glucose transporters，葡萄糖轉運蛋白)結構域(編號：cd17315)。因此，紅肉火龍果TST家族屬于MFS超家族，具有潛在的葡萄糖轉運活性。

2.3 跨膜結構及亞細胞定位預測

從表3看出，HpTST1、HpTST2.1和HpTST3均含有11個跨膜域，N端位于細胞外。HpTST2.2含有12個跨膜域，N端位于細胞內。亞細胞定位預測表明，HpTST1定位于質體、葉綠體或內質網，HpTST2.1和HpTST2.2定位于質體或液泡，HpTST3定位于葉綠體、質體或液泡。

表3 紅肉火龍果 TST基因的跨膜結構域和預測定位

2.4 TST基因分類

根據紅肉火龍果TST基因的氨基酸序列以及擬南芥、西瓜、甜瓜、甜菜、葡萄和蘋果等TST基因家族共同構建的系統發育樹(圖1)，TST基因明顯分為3類，其中，HpTST1與擬南芥AtTMT1、葡萄VvTMT1、蘋果MdTMT1、甜菜BvTST1、西瓜ClTST1和甜瓜CmTST1均屬于TST1類；HpTST2.1和HpTST2.2與擬南芥AtTMT2、葡萄VvTMT2、蘋果MdTMT2-3、甜菜BvTST2.1和BvTST2.2、西瓜ClTST2和甜瓜CmTST2屬于TST2類；HpTST3與擬南芥AtTMT3、葡萄VvTMT3甜菜BvTST3、西瓜ClTST3和甜瓜CmTST3均屬于TST3類。

3 結論與討論

近年來大量植物基因組序列的發布，為全基因組范圍基因家族的分離奠定了有利基礎。通過對基因組序列的檢索，植物TST家族普遍含有2～5個成員。如甜橙含2個成員[10]，擬南芥、葡萄、西瓜和甜瓜均含3個成員[5,9,14-15]，甜菜含有4個成員[7]，蘋果含5個成員[8]。目前尚無火龍果基因組序列的發布，僅能通過其莖和果實等組織的轉錄組數據分離其TST基因家族。本研究分離的火龍果TST基因家族含有4個成員，與上述物種中TST成員數量基本一致。火龍果與甜菜同屬于石竹目(Caryophyllales)，親緣關系較近，其TST基因家族數量相同[7]。這些不同物種的TST基因家族成員可分為三類，TST1類均含有1個成員，TST2和TST3類發生不同程度的基因數量增加。如蘋果TST2和TST3類均有2個成員[8]，火龍果與甜菜TST2類均含有2個成員[7]，梨TST2和TST3類分別有3個和2個成員[11]。因蘋果、梨、火龍果和甜菜均積累豐富的可溶性糖，由此推測基因數量的增加可能與其可溶性糖大量積累的性狀保持一致。

TST最初被命名為液泡單糖轉運蛋白(Tonoplast monosaccharide transporter，TMT)，因其具有跨液泡膜輸入單糖的特性，參與液泡可溶性糖積累[5]。隨后的研究證明擬南芥AtTMT1同時具有蔗糖轉運活性，甜菜BvTST2.1具有特異轉運蔗糖的活性，因而被統一命名為TST[6-7]。擬南芥AtTMT1基因突變后降低其葉肉細胞液泡葡萄糖吸收活性，進而導致葉片積累的可溶性糖含量降低[5]。過表達AtTMT1基因提高葉片可溶性糖含量，種子產量、蛋白質和脂類含量均明顯增加[17]。在園藝作物果實中，蘋果MdTST1基因隨果實成熟顯著上調表達，與果實可溶性糖積累模式的相關系數高達0.837[8]。桃PpTST1基因的表達與果實可溶性糖積累模式保持一致，在果實中瞬時沉默其表達，降低果實可溶性糖含量[18]。由此可見，TST1類參與葉片和果實可溶性糖的跨液泡膜輸入，促進組織的可溶性糖積累。火龍果HpTST1與擬南芥AtTMT1同屬于TST1類，推測其參與果實的可溶性糖積累。

目前在積累大量可溶性的貯藏根和果實中均已證明TST2類與可溶性糖積累密切相關，是控制可溶性糖含量的重要正調控因子。甜菜BvTST2.1蛋白在根部液泡膜上大量表達，具有特異性跨膜轉運蔗糖的活性，高蔗糖品種中的基因表達顯著高于低蔗糖品種[7]。西瓜ClTST2和梨PbTMT4均具有蔗糖、葡萄糖和果糖轉運活性、基因表達量與可溶性糖含量正相關[14]；甜瓜CmTST2基因在高蔗糖品種中的表達明顯高于低蔗糖品種，該基因過表達增加草莓和黃瓜果實可溶性糖含量[15]。研究獲得的火龍果TST2類含有2個成員，與甜菜TST家族的序列同源性較高，推測具有蔗糖、葡萄糖和果糖等轉運活性，參與果實可溶性糖積累。

研究獲得火龍果TST基因家族4個成員，均具有典型的TST家族特征，含有1個TST1類成員和2個TST2類成員。結合目前在其他物種中相關研究結果，推測HpTST1、HpTST2.1和HpTST2.2是參與果實可溶性糖積累的重要候選基因。下一步需要分析上述基因的表達模式、亞細胞定位和糖轉運活性，從而闡明其在火龍果果實可溶性糖積累中的生理功能，為探討果實可溶性糖積累的分子機制和調控果實品質奠定基礎。