表達HIV-1 CRF01_AE亞型結構基因小鼠模型的建立和鑒定

郭婷婷 ，岳成 ，徐柯 ，周玉柏

1.北京工業(yè)大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124；2.中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所，北京 100052

人類免疫缺陷病毒1型（human immunodefi?ciency virus type 1，HIV-1）感染導致的獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syn?drome，AIDS）也稱為艾滋病，是一種可通過多種途徑傳播且潛伏期較短的傳染病，目前已成為世界范圍內威脅人類健康的重大社會和公共衛(wèi)生問題[1-2]。流行病學調查顯示，2017年全球共有180萬新發(fā)病例，約94萬人死于與艾滋病相關的疾病[3]。雖然1996年進入臨床應用的高效抗反轉錄病毒療法（highly active antiretroviral therapy，HAART）能夠抑制HIV復制，但該療法只能部分緩解免疫失調和免疫功能喪失[4]，并不能徹底清除HIV，且治療中還會伴隨一系列諸如神經認知障礙、肝腎衰竭、心臟疾病等嚴重的并發(fā)癥[5-6]。從疾病控制的長遠戰(zhàn)略看，研制有效的HIV疫苗，通過機體免疫獲得HIV中和抗體或特異性細胞免疫以清除體內HIV，不失為一種預防HIV感染、控制病毒傳播，以及延緩疾病進程的經濟且高效的方法。

HIV在傳播和進化過程中產生了不同的亞型。研究顯示，我國HIV-1的流行株雖然仍以B′/C亞型為主，但近年來AE亞型占比呈逐漸增多的趨勢[7-8]。因此，針對B′/C亞型的HIV疫苗難以滿足當前形勢的要求。本課題組前期構建了針對我國HIV-1 CRF01_AE亞型的HIV-gp160疫苗，但缺少評價該疫苗臨床前免疫效果的生物學工具。在本研究中，我們擬構建并鑒定攜帶HIV-1 CRF01_AE gp160基因的細胞和小鼠模型，建立評價HIV-1 CRF01_AE亞型疫苗免疫效果的體內外模型，為我國HIV-1 CRF01_AE亞型HIV疫苗的進一步開發(fā)奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠購自并飼養(yǎng)于中國疾病預防控制中心實驗動物中心；293T細胞為中國疾病預防控制中心病毒病所曾毅院士實驗室保存；TC-1細胞（小鼠肺上皮細胞）購自北京協(xié)和醫(yī)院；大腸桿菌BMStbl3感受態(tài)細胞購自北京博邁德基因技術有限公司；攜帶密碼子優(yōu)化HIV-1 CRF01_AE亞型gp160基因的pVR-AE gp160質粒及Lenti-X HTX慢病毒包裝系統(tǒng)均由中國疾病預防控制中心病毒病所提供；限制性內切酶EcoRⅠ-HF、BamHⅠ-HF購自New England Biolabs（北京）有限公司；質粒大量提取試劑盒QIAGEN Plamid Mega Kits、基因組DNA提取試劑盒AllPrep DNA/RNA Mini Kit均購自QIAGEN公司；引物由北京擎科生物技術有限責任公司合成；羅氏真核細胞轉染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent與TRIzol試劑購自北京靜遠康生物技術發(fā)展有限公司；Anti-HIV gp160抗體購自Abcam公司；FITC標記的兔抗山羊IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；GFP（D5.1）XP抗體購自北京鴻拓嘉禾科技有限公司；多聚甲醛固定液購自Solarbio公司。

1.2 穩(wěn)定表達HIV AE gp160基因的TC-1細胞的構建

用限制性內切酶EcoRⅠ-HF和BamHⅠ-HF將HIV-1AE亞型gp160基因克隆到慢病毒穿梭質粒pLVE-IRES-eGFP中，獲得攜帶密碼子優(yōu)化型gp160基因的重組質粒pLVX-AE gp160；利用Lenti-X HTX慢病毒包裝系統(tǒng)與重組質粒pLVXAE gp160共轉染293T細胞獲得重組慢病毒LVGFP-AE gp160。測得滴度為1.28×108TU/mL的重組慢病毒LV-GFP-AE gp160感染1×105TC-1細胞，嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達gp160基因的TC-1-HIV AE gp160細胞。

1.3 RT-PCR法檢測AE gp160基因在TC-1-HIV AE gp160細胞中的表達

提取細胞總RNA，設計擴增引物F（5'-GGA ATTCCGCCACCATGAGAGTGAGAG-3'）和 R（5'-C GGATCCTTACAACTAGAAGGCACAGCA-3'），采用TaKaRa PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒擴增gp160基因（RT-PCR反應條件：50℃30 min，94℃ 2 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃1 min，30個循環(huán)）。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送北京擎科生物技術有限公司測序。

1.4 流式細胞術檢測TC-1-HIV AE gp160細胞中Gp160蛋白的表達

收集5×105TC-1-HIV AE gp160細胞，加入終濃度為50 μg/mL的Anti-HIV gp160抗體，室溫避光孵育60 min，洗滌后加入1∶200稀釋的FITC標記的兔抗山羊IgG（二抗），室溫孵育45 min，設置不孵育抗體的空白對照與只孵育FITC標記的兔抗山羊IgG的陰性對照，3組洗滌后上流式細胞儀進行檢測。

1.5 表達AE Gp160蛋白的小鼠模型的建立及免疫組化鑒定

分別將3×105、4×105、5×105穩(wěn)定表達 Gp160 蛋白的TC-1-HIV AE gp160細胞接種到C57BL/6小鼠背部，最終確定能1周成瘤的50萬個細胞數(shù)作為接種細胞數(shù)，分離接種TC-1-HIV AE gp160細胞7 d后形成的細胞團塊，多聚甲醛4℃固定，石蠟包埋切片，非免疫正常山羊血清封閉30 min，吸除封閉液，孵育稀釋比為1∶50的GFP（D5.1）XP抗體4℃過夜，PBST沖洗5次各5 min，孵育HRP標記的二抗，室溫孵育30 min，PBST沖洗5次各5 min。蘇木素溶液染色后進行乙醇梯度水化，二甲苯透明2次各5 min，石蠟切片中央滴加中性樹脂封片觀察，PBS緩沖液做對照實驗。

2 結果

2.1 重組質粒pLVX-AE gp160的酶切鑒定

用高保真酶EcoRⅠ-HF與BamHⅠ-HF雙酶切重組質粒pLVX-AE gp160，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示gp160擴增片段約為2600 bp，與預期一致，說明gp160基因插入慢病毒載體，重組質粒構建成功（圖1）。

2.2 GFP熒光鑒定

測得滴度為1.28×108TU/mL的重組慢病毒LV-GFP-AE gp160感染1×105TC-1細胞，48 h后熒光顯微鏡下觀察TC-1-HIV AE gp160細胞呈現(xiàn)較強的綠色熒光，說明外源基因可以在重組慢病毒中表達（圖2）。

2.3 RT-PCR鑒定TC-1-AE gp160細胞

RT-PCR結果見圖3，擴增的gp160基因片段約為2600 bp，說明gp160基因成功插入TC-1-HIV AE gp160細胞基因組。

圖1 重組質粒pLVX-AE gp160的酶切鑒定

圖2 TC-1-HIV AE gp160細胞熒光圖

圖3 TC-1-HIV AE gp160細胞的RT-PCR鑒定

2.4 流式細胞術鑒定TC-1-AE gp160細胞

收集TC-1-HIV AE gp160細胞總蛋白，設置的空白對照（圖4A、B）與陰性對照（圖4C、D）組只出現(xiàn)1個峰值，說明無熒光信號；實驗組與對照組實驗重復3次，圖4E、F結果表明TC-1-HIV AE gp160細胞中有較強的熒光信號，即外源基因表達的Gp160蛋白可以在TC-1-HIV AE gp160細胞表面暴露。

2.5 免疫組化鑒定表達AE Gp160蛋白的小鼠模型

免疫組化及HE染色結果顯示，小鼠體內接種的TC-1-HIV AE gp160細胞能形成細胞團塊，TC-1-HIV AE gp160細胞團塊呈紅褐色，而對照組組織中無色，表明外源基因可以在小鼠體內形成的細胞團塊中表達，提示可能成功構建了表達外源基因的小鼠模型（圖5）。

3 討論

艾滋病是一種傳染性較強且潛伏期短的傳染病，缺少特效治療藥物。目前有效的疫苗接種仍是HIV-1感染導致的艾滋病的最主要的治療方法，其中對治療性疫苗的研發(fā)最多。截至2017年4月3日，國際艾滋病疫苗促進組織的研發(fā)數(shù)據(jù)庫中有43個艾滋病候選疫苗進入臨床試驗[9]，其中Ⅰ期31個、Ⅰ/Ⅱ期3個、Ⅱ期8個、Ⅲ期1個。HIV疫苗的研發(fā)主要以HIV結構基因為靶點，HIV結構基因env表達的膜蛋白Gp160可誘導機體產生特異性免疫應答，在艾滋病相關免疫治療中被認為是良好的靶抗原。研究表明，進行艾滋病疫苗研究、藥物治療和發(fā)病機制研究的必要條件之一是細胞模型和動物模型的構建。艾滋病疫苗研發(fā)的主要障礙之一是HIV的高效變異性，因而缺乏有效的動物模型[10]。考慮到經濟效應及遺傳、代謝、免疫等研究進展，小鼠作為模式動物成為艾滋病疫苗模型研究的焦點。小鼠本身沒有CD4特異性受體，無法直接用于HIV-1的感染研究[11]，但可作為靶向疫苗的評價模型動物，為疫苗的臨床前效果評價提供了研究模型。對于HIV疫苗的臨床前效果評價，攜帶靶抗原的小鼠模型尤為重要。目前關于檢測HIV疫苗的靶向治療效果已有針對小鼠模型建立的研究。TC-1在細胞模型中廣泛用于疫苗特異性免疫應答評價和體外抗腫瘤效果評價，均為本實驗的可行性提供了有益參考。本實驗構建的TC-1-HIV AE gp160小鼠模型和體外細胞模型，目的是滿足前期已構建的HIV疫苗的免疫評價需要，進一步完善HIV疫苗評價模型的相關研究。

圖4 流式細胞術檢測TC-1-HIV AE gp160細胞gp160基因表達

圖5 GFP蛋白在小鼠組織中的表達（HE染色和IHC）

慢病毒載體基于HIV-1發(fā)展而來，該載體能夠使外源基因整合到宿主細胞基因組中，并隨細胞基因組的分裂而分裂，過程持續(xù)且穩(wěn)定。本研究選用慢病毒pLVX包裝系統(tǒng)，構建攜帶gp160基因的小鼠模型。首先用慢病毒載體構建重組質粒，利用慢病毒包裝系統(tǒng)Lenti-X HTX，通過細胞內同源重組獲得攜帶靶基因gp160的重組慢病毒，重組慢病毒感染小鼠細胞TC-1，外源基因gp160以轉座子的形式插入小鼠腫瘤細胞TC-1的基因組，經嘌呤霉素抗性篩選后獲得表達外源基因gp160的TC-1細胞。為成功構建穩(wěn)定表達Gp160蛋白的小鼠模型，選擇2種小鼠腫瘤細胞系，分別是P815（小鼠肥大腫瘤細胞）及TC-1（小鼠肺上皮腫瘤細胞），目的是為防止后期免疫小鼠出現(xiàn)排斥反應。但是，由于攜帶gp160基因的P815細胞中Gp160蛋白表達不穩(wěn)定，經抗性篩選后外源基因容易丟失，因此選擇了生長速度快且經抗性篩選后仍穩(wěn)定表達Gp160的TC-1細胞。將50萬個穩(wěn)定表達Gp160的TC-1細胞接種C57BL/6小鼠，免疫組化及HE染色結果顯示，小鼠體內接種的TC-1-HIV AE gp160細胞能形成細胞團塊，且可能有Gp160蛋白表達。

綜上，我們建立了穩(wěn)定表達Gp160蛋白的小鼠模型和體外細胞模型，為HIV-1相關疫苗臨床前的全面評價提供了模型，也為HIV-1相關疫苗的臨床申請?zhí)峁┝藬?shù)據(jù)支持。