祛瘀生新膠囊化學成分超高效液相色譜-串聯質譜法分析及含量測定*

陳 娟，狄志彪，王 娣，穆慶麗，郭 冬

（陜西省中醫藥研究院，陜西 西安 710003）

祛瘀生新膠囊為陜西省中醫醫院院內制劑（陜藥制字Z20150050），由三棱、莪術、桂枝、黃芪、土貝母、制馬錢子粉6 味中藥組方，具有破血行氣、散結止痛功效，用于治療風寒濕邪等多種原因引起的髖部疼痛、腫脹、屈伸活動受限、行走困難等功能障礙性疾病，臨床適用于股骨頭無菌性壞死（Ⅰ-Ⅱ期）引起的髖關節疼痛［1-3］。該制劑中有23 個化學成分，本研究中以其中的活性成分黃芪甲苷［4］、有效成分及毒性成分士的寧［5］為含量測定指標，建立了祛瘀生新膠囊中士的寧含量測定的高效液相色譜（HPLC）法和黃芪甲苷含量測定的高效液相色譜-蒸光發散射檢測器（HPLC-ELSD）法，以使其質量可控。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Scientific Q Exactive Focus 型質譜儀，Thermo Fisher U3000 型超高效液相色譜儀，均購自美國賽默飛世爾科技公司；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；BS210S 型電子天平（精度為萬分之一），BT25S 型電子天平（精度為十萬分之一），均購自北京賽多利斯天平有限公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；KH-300D 型數控超聲波清洗儀（昆山禾創超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

士的寧對照品（批號為110705-200306），黃芪甲苷對照品（批號為110746-200620），均購于中國食品藥品檢定研究院；祛瘀生新膠囊（陜西省中醫醫院自制，批號分別為20181201，20181202，20181203，規格為每粒0.3 g）；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）定性分析

2.1.1 色譜及質譜條件

色譜條件：色譜柱為Accucore AQ C18柱（150 mm×150 mm，2.6 μm）［6-7］；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0 ～10 min 時95%A ～40%A，10 ～20 min 時40%A ～5 %A，20 ～22 min 時5%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為3 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（HESI）；噴霧電壓為3.50kV；離子傳輸管溫度為320 ℃；鞘氣流速為40 arb；輔助氣體流速為30 arb；輔助氣體溫度為350 ℃；掃描方式為Full MS/dd-MS2；采集范圍為質荷比（m/ z）100 ～1 500；采集模式為正離子模式［8］。

2.1.2 溶液制備

取本品約0.3 g，精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，加入50 mL 75%甲醇水溶液，超聲提取30 min（功率為300 W，頻率為50 kHz），吸取上清液5 mL，置50 mL容量瓶中，用75%甲醇水溶液定容，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.3 定性分析

采用正離子模式進行定性分析。根據各色譜峰的一級碎片離子m/ z、保留時間、分子離子峰及主要的二級碎片離子，參照相關文獻和化學專業數據庫收錄的化學成分，對色譜圖進行了峰歸屬分析，初步鑒定出23 個主要化學成分，23 個化合物成分及其相關質譜數據見表1。祛瘀生新膠囊的質譜總離子流圖見圖1。

圖1 祛瘀生新膠囊樣品總離子流圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

士的寧：色譜柱為Welchrom C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液（15 ∶85，V/ V）；檢測波長為260 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min。士的寧的分離度不得低于1.5，理論板數不低于5 000。

黃芪甲苷：色譜柱為Welchrom C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（32 ∶68，V/ V）；流速為1.0 mL / min；柱溫為30 ℃；蒸發光散射檢測器，漂移管溫度為60 ℃；流速為2.2 mL/min；載氣壓為0.5 MPa。黃芪甲苷的分離度不得低于1.5，理論板數不低于5 000。

表1 祛瘀生新膠囊主要化學成分UPLC-MS/MS 定性分析結果

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取士的寧對照品適量，精密稱定，加三氯甲烷溶解并制成質量濃度為0.055 mg/mL 的士的寧對照品溶液。取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成質量濃度為0.245 mg/mL 的黃芪甲苷對照品溶液。

供試品溶液：取本品約0.3 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加三氯甲烷20 mL 和氨水1 mL，水浴加熱回流1 h，放冷濾過，濾渣用三氯甲烷洗滌3 次，每次20 mL，合并濾液和洗液，置水浴蒸干，蒸干后殘渣加三氯甲烷溶解并定量轉移至10 mL 容量瓶中，以三氯甲烷定容，搖勻，濾過，取續濾液，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得士的寧供試品溶液。取本品約9.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇100 mL，超聲處理45 min，濾過，濾液置水浴蒸干，加160 mL 水溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2 次，每次40 mL，棄去氨試液，正丁醇液水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至10 mL 容量瓶中，以甲醇定容，搖勻，濾過，取續濾液，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得黃芪甲苷供試品溶液。

陰性對照品溶液：按處方工藝分別制備缺制馬錢子和缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別吸取士的寧對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，進樣分析。結果士的寧峰形良好，與相鄰色譜峰能達到基線分離，陰性對照品溶液在士的寧色譜圖主峰位置無對應峰出現，表明陰性對照無干擾。同法測得處方中其他成分對黃芪甲苷的含量測定無影響。色譜圖見圖2。

線性關系考察：分別精密吸取士的寧對照品溶液和黃芪甲苷對照品溶液各2，4，8，12，16，20 μL，按各自擬訂的色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以峰面積（Y）對進樣量（X）進行線性回歸，得士的寧回歸方程Y=2 241.6X-6.499 2（r=0.999 9）。結果表明，士的寧進樣量在0.11 ～1.10 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。以黃芪甲苷峰面積的自然對數值（Y）對黃芪甲苷進樣量的自然對數值（X）進行線性回歸，得黃芪甲苷回歸方程Y=1.343 4X+4.467 3（r=0.999 2）。結果表明，黃芪甲苷進樣量在0.49 ～4.90 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取同一士的寧對照品溶液和黃芪甲苷對照品溶液各10 μL，按各自擬訂的色譜條件連續進樣6 次，測定峰面積。結果士的寧、黃芪甲苷峰面積的RSD分別為0.41%和0.46%（n=6），表明儀器的精密度良好。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為20181201）6 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算含量。結果士的寧的平均含量為1.474 0 mg/g、RSD為1.45% （n=6），黃芪甲苷的平均含量為0.244 3 mg/g、RSD為0.77% （n=6），表明方法重復性良好。

圖2 高效液相色譜圖

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h 時按擬訂色譜條件進樣分析，記錄各時間點的峰面積。結果士的寧峰面積的RSD為1.38%（n=7），黃芪甲苷峰面積的RSD為1.25% （n=7），表明供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）

耐用性試驗：取2.2.2 項下供試品溶液，按擬訂色譜條件（分別調整柱溫、流速和色譜柱）同法測定，考察士的寧和黃芪甲苷的含量變化。結果士的寧的平均含量為1.495 0 mg/g、RSD為0.56%，黃芪甲苷的平均含量為0.244 0 mg/g、RSD為0.43%，表明方法耐用性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20181201）0.15 g，平行取6 份，精密稱定，每份樣品加入質量濃度為0.055 mg/mL 的士的寧標準品溶液4 mL；取已知含量的樣品（批號為20181201）4.65 g，平行取6 份，精密稱定，每份樣品加入質量濃度為0.406 mg/mL的黃芪甲苷標準品溶液3 mL。分質量別依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，并計算士的寧和黃芪甲苷的加樣回收率，結果見表2。

2.2.4 樣品含量測定

分別取3 批樣品（批號分別為20181201，20181202，20181203），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算樣品中士的寧和黃芪甲苷的含量。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 測定指標選擇

三棱為方中君藥，能破血行氣、散結止痛。采用網絡藥理學方法篩選制劑中的成分，從中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、美國國家生物技術信息中心（NCBI）和中醫百科全書（ETCM）3 個數據庫中共獲得551 個成分。經ADME 虛擬篩選，潛在活性成分為223 個，通過靶點識別和疾病映射共獲得活性成分136 個；通過分子網絡分析，篩選出關鍵活性成分為亞油酸、蘆丁、2-甲基-N-苯基馬來酰亞胺、士的寧，黃芪甲苷、二氫丁香酚等10 個成分；再次采用UPLC-MS/MS 法鑒定出該制劑中有蔗糖、士的寧、馬錢苷酸、蘆丁、黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪異黃烷苷等23 個主要化學成分，與上述重疊的成分主要為蘆丁、士的寧和黃芪甲苷。蘆丁（三棱總黃酮）具有較強的抗血小板聚集、抗血栓、鎮痛作用，是破血化癖的有效活性部位［9］，其含量測定方法已制訂［10］。制馬錢子可散血熱、消腫止痛，也可調和諸藥，士的寧是馬錢子鎮痛主要活性生物堿，含有毒性［11-12］，應作為質量標準中含量控制指標性成分之一。士的寧可用于偏癱、癱瘓及因注射鏈霉素引起的骨骼肌松弛、弱視癥等［13］，對脊髓、延髓、大腦皮質等神經系統及消化系統有一定的藥理作用［14］。黃芪可補氣行氣，黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪異黃烷苷均為其主要化學成分，其中黃芪甲苷為活性成分之一，具有增強機體免疫、增強機體耐缺氧及應激能力、治療糖尿病、抗病毒等作用［15-16］。因此，將士的寧和黃芪甲苷作為祛瘀生新膠囊的質量控制指標性成分具有可行性。

3.2 UPLC-MS/MS 條件篩選

基于UPLC-MS/MS 技術分析方法，對樣品分別進行了正、負離子質譜掃描，結果在正離子掃描模式下化合物具有較好的響應值，而在負離子掃描模式下化合物響應較差，分析得到的化合物數量很少。因此，本研究中采用正離子掃描模式對樣品進行全面分析和測定。

3.3 供試品制備方法選擇

由于該制劑中的中藥成分復雜，干擾成分較多，在測定士的寧時進行了超聲提取和回流提取，結果回流提取的士的寧含量較高，故選擇回流提取。通過對祛瘀生新膠囊前處理、對供試品制備方法的優化（包括樣品的超聲提取，超聲時間和正丁醇提取次數和用量及氨洗次數和用量），發現本研究中的處理方法簡便且優化。

3.4 方法評價

本研究中采用HPLC 法和HPLC-ELSD 法分別測定士的寧和黃芪甲苷的含量，靈敏度高，重復性好，結果準確，專屬性強。