五味子糖漿中6 種抑菌劑篩查與分析

肖 引，王 皎，陳 江△

（1. 武警陜西省總隊醫院臨床藥學室，陜西 西安 710054； 2. 西安國際醫學中心，陜西 西安 710077）

五味子糖漿收載于2015年版《中國藥典（一部）》，具有益氣生津、補腎寧心功效。其制法為取五味子粉碎成粗粉，取100 g，用30%乙醇浸漬72 h 后，緩緩滲漉，收集滲漉液至相當于原藥材的2 倍，濾過；另取蔗糖600 g，制成糖漿，加入上述濾液中，再加入苯甲酸鈉及桔子香精適量，混勻，加水調至1 000 mL［1］。制法顯示，五味子糖漿僅使用苯甲酸鈉作為抑菌劑。參考文獻［2-3］報道的高效液相色譜（HPLC）法，本研究中篩查了3 家不同企業10 批樣品中抑菌劑的使用情況。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BS224S 型電子分析天平（德國塞多利斯公司，精度為0.1 mg）；BP211D 型電子分析天平（德國塞多利斯公司，精度為0.1 mg）；AE 240 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為0.1 mg）；Shimadzu LC 2030 3D型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Empower 色譜工作站（美國Waters 公司）；KQ0500-DE 型數控超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

苯甲酸對照品（批號為100419-201703，含量為99.9%），山梨酸對照品（批號為190126-201501，含量為99.6% ），對羥基苯甲酸甲酯對照品（批號為100278-201705，含量為100%），對羥基苯甲酸丙酯對照品（批號為100444-201403，含量為99.6%），對羥基苯甲酸丁酯對照品（批號為110792-200503，含量為100%），均由中國食品藥品檢定研究院提供；對羥基苯甲酸乙酯對照品（德國Ehrenstorfer Quality，批號為G128088，含量為99.0% ）；10 批五味子糖漿（市售品，編號為S1 ～S10）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：含0.02 mol / L 乙酸銨的0.08%冰醋酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫程度見表1；檢測波長：255 nm。理論板數按對羥基苯甲酸乙酯峰計應不低于4 000。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

精密量取樣品5 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。取苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.05 mg 的混合溶液，作為對照品溶液。精密量取自制苯甲酸陰性五味子糖漿5 mL，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2 項下3 種溶液，按擬訂色譜條件各進樣5 μL，記錄色譜圖。陰性對照品溶液色譜中，在與苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯混合對照品溶液色譜相應位置上無相應色譜峰。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：取苯甲酸9.89 mg、山梨酸8.50 mg、對羥基苯甲酸甲酯9.01 mg、對羥基苯甲酸乙酯9.06 mg、對羥基苯甲酸丙酯10.41mg、對羥基苯甲酸丁酯10.26mg，精密稱定，分別置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為貯備溶液，將貯備溶液稀釋成質量濃度分別為0.197 80，0.034 00，0.036 04，0.036 24，0.041 64，0.041 04 mg/mL 的混合標準溶液，分別精密吸取2，6，10，15，20，25 μL 注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄其峰面積，以進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯的回歸方程分別為Y苯=437 838.2X苯（r=0.999 9），Y山=10 889 020X山（r=0.999 8），Y甲酯=5 201 898X甲酯（r=0.999 9）、Y乙酯=4 837 995X乙酯（r=0.999 8）、Y丙酯=4 414 243X丙酯（r=0.999 8）、Y丁酯=4 129 725X丁酯（r=0.999 8）。結果表明，苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯進樣量分別在0.396 ～4.945 μg，0.068 ～8.50 μg，0.0721 ～0.901 μg，0.0725 ～0.906 μg，0.083 28 ～1.041 μg，0.082 08 ～1.026 μg 范圍內與各峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液5 μL，重復進樣6 次，記錄各組分的峰面積。結果的RSD在0.28% ～0.36%（n=6）范圍內，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，記錄苯甲酸和對羥基苯甲酸乙酯的峰面積。結果的RSD分別為0.23%和0.26%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為170201）樣品，平行量取6 份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結果樣品中苯甲酸的平均含量為1.475 mg / mL、RSD為1.80% （n=6），對羥基苯甲酸乙酯的含量為0.425 mg/mL、RSD為1.79% （n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批（批號為170201）樣品，精密量取6 份，每份2.5 mL，分別置容量瓶中，再各精密加入混合對照品溶液5 mL（苯甲酸質量濃度為0.739 6 mg/mL，山梨酸質量濃度為1.244 mg / mL、對羥基苯甲酸甲酯質量濃度為0.463 6 mg / mL，對羥基苯甲酸乙酯質量濃度為0.200 2 mg / mL，對羥基苯甲酸丙酯質量濃度為0.474 mg/mL，對羥基苯甲酸丁酯質量濃度為0.418 4 mg/mL），依法制備供試品溶液，精密吸取5 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（ n=6）

表3 10 批樣品抑菌劑含量測定結果（mg/mL）

2.4 樣品含量測定

取10 批五味子糖漿，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算苯甲酸及對羥基苯甲酸乙酯的含量。結果見表3。

3 討論

防腐劑有苯甲酸、山梨酸、尼鉑金類、苯扎氯銨類等，在多數情況下是安全的，但選擇不當或超劑量使用會產生不良反應，危害人體健康［4-5］。2015年版《中國藥典（四部）》規定了糖漿劑中添加防腐劑含量：山梨酸和苯甲酸的用量不得超過0.3% （其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計），羥苯酯類的用量不得超過0.05%［6］。苯甲酸抑菌劑對細菌的最適pH 為2.5 ～4.0。分子態苯甲酸的抑菌活性較離子態高，在pH ＜4 時，完全抑制的最低濃度為0.05% ～0.1%；當pH ＞6 時，抑菌活性顯著降低。對羥基苯甲酸酯即尼泊金酯是國際公認的廣譜性高效安全的食品防腐劑，廣泛用于食品、化妝品及醫藥等行業［7-9］。

結合文獻［10-15］，本研究中建立了五味子糖漿抑菌劑的篩查方法。10 批樣品的苯甲酸含量差異不同，較低含量可能原因為糖漿劑長期放置過程中部分抑菌劑存在降解，試驗結果為企業添加防腐劑限量提供了參考意義。

尼泊金酯類（對羥甲基苯甲酸乙酯）防腐劑對霉菌、酵母菌和細菌有廣泛的抗菌作用，該防腐劑的作用在于未電離分子發揮抗菌活性，抑制微生物細胞的呼吸酶系與電子傳遞酶系的活性，以及破壞微生物的細胞膜結構；且隨著烷鏈的增加抗菌效力增強，適用于中性溶液的防腐。但通過檢測10 批樣品的pH，測定結果均在2.58 ～3.79 之間，表明五味子糖漿使用苯甲酸抑菌劑具有合理性。但沒有必要再使用對羥甲基苯甲酸乙酯防腐劑，且存在擅自改變工藝添加抑菌劑的風險。