高效液相色譜法測(cè)定養(yǎng)陰合劑中哈巴俄苷含量*

丁家昱，車坷科△，申麗莎，楊

（1. 重慶市人民醫(yī)院·中國(guó)科學(xué)院大學(xué)重慶醫(yī)院，重慶 400015； 2. 重慶市中藥研究院，重慶 400061；3. 重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121）

養(yǎng)陰合劑為20 世紀(jì)50年代重慶市人民醫(yī)院耳鼻喉科老中醫(yī)的祖?zhèn)黩?yàn)方，由連翹、玄參、黃芩、地黃、麥冬、桔梗、大青葉7 味藥材經(jīng)水煎煮提取制成，具有滋陰涼血、清熱解毒功效，主要用于治療咽炎、咽喉腫痛等癥，效果良好。目前收載于重慶市食品監(jiān)督管理局編制的2008年版《重慶市醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》，由于該藥組分復(fù)雜，現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅收載有制法、性狀和相對(duì)密度檢查，以及合劑制劑通則檢查，可控性較差，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有待提高、完善。方中玄參具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)的功效，主要成分為哈巴苷和哈巴俄苷。參考文獻(xiàn)［1-11］，本研究中建立了測(cè)定養(yǎng)陰合劑中玄參活性成分哈巴俄苷含量的高效液相色譜（HPLC）法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；BP211S 型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司，精度為十萬(wàn)分之一）；Simplicity-185 型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）。

1.2 試藥

哈巴俄苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111730-201307，含量為97.1%）；養(yǎng)陰合劑（重慶市人民醫(yī)院，批號(hào)分別為190410，190612，190813，規(guī)格為每瓶250 mL）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters SunFire C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（55 ∶45，V/ V）；流速：1.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，供試品溶液色譜中哈巴俄苷峰分離度大于1.5，理論板數(shù)大于15 000。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 溶液制備

取哈巴俄苷對(duì)照品22.50 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液；精密量取對(duì)照品貯備液2 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。精密量取樣品2 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置1 h，取上清液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例和制備工藝制備缺玄參的陰性樣品，按供試品制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密量取2.2 項(xiàng)下3 種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，哈巴俄苷與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離；陰性對(duì)照品溶液色譜圖中，哈巴俄苷對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)位置上無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明雜質(zhì)及陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定均無(wú)干擾，方法專屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察：取哈巴俄苷對(duì)照品23.03 mg，精密稱定，依法制備對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液1，5，10，15，20 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=2×106X-11 787，r=0.999 9（n=5）。結(jié)果表明，哈巴俄苷進(jìn)樣量在0.044 72 ～0.894 50 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5 次，記錄峰面積。結(jié)果表明，哈巴俄苷峰面積的RSD為0.72%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，結(jié)果哈巴俄苷峰面積的RSD為1.12%（n=6），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。依法制備對(duì)照品溶液，分別于0，1，2，3 d 時(shí)進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，結(jié)果哈巴俄苷峰面積的RSD為0.91%（n=6），表明對(duì)照品溶液在室溫下放置3 d 穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為190612）樣品適量，精密稱定，混勻，依法制備供試品溶液，共6 份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定哈巴俄苷的含量。結(jié)果平均含量為0.394 1 mg/mL，RSD為1.63%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的同一批（批號(hào)為190612）樣品1 mL，共6 份，分別置25 mL 容量瓶中，精密加入上述對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.044 72 mg/mL）10 mL，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 哈巴俄苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

按擬訂方法測(cè)定批號(hào)分別為190410，190612，190813 的3 批養(yǎng)陰合劑中哈巴俄苷的含量，結(jié)果分別為0.344 9，0.394 1，0.352 7 mg/mL。

3 討論

3.1 活性成分及色譜條件選擇

2015年版《中國(guó)藥典（一部）》中玄參項(xiàng)下采用乙腈-0.03%磷酸溶液梯度洗脫測(cè)定哈巴苷和哈巴俄苷的含量，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。在此條件下，養(yǎng)陰合劑中雜質(zhì)峰嚴(yán)重干擾哈巴苷色譜峰，使其未能得到有效分離。參考文獻(xiàn)［1-10］，中藥復(fù)方制劑中哈巴苷與哈巴俄苷/哈巴俄苷的含量測(cè)定均采用HPLC 法，經(jīng)試驗(yàn)考察，養(yǎng)陰合劑中哈巴苷色譜峰均受雜質(zhì)峰干擾，不能有效分離。最終參考2015年版《中國(guó)藥典（一部）》收載的玄麥甘桔系列制劑［1］（含片、膠囊、顆粒）中的含量（以哈巴俄苷為控制指標(biāo)）測(cè)定方法，測(cè)定養(yǎng)陰合劑成分玄參中含量較高的哈巴俄苷以控制產(chǎn)品質(zhì)量。色譜條件中流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（55 ∶45，V/ V），檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。結(jié)果顯示，養(yǎng)陰合劑樣品中哈巴俄苷色譜峰分離良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾，檢測(cè)靈敏度較高。經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器（DAD）檢測(cè)，樣品中哈巴俄苷色譜峰與哈巴俄苷對(duì)照品色譜峰UV 光譜一致。

3.2 溶劑選擇

分別采用50%甲醇和甲醇稀釋樣品進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩者均能起到醇沉作用，除去樣品中部分雜質(zhì)，靜置1 h 后取上清液經(jīng)濾過(guò)后進(jìn)樣，色譜峰分離情況均較好，其中甲醇的雜質(zhì)峰更少，故最終選擇甲醇作為溶劑。

3.3 色譜柱考察

對(duì)3 支不同品牌的色譜柱對(duì)供試品溶液進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果樣品中哈巴俄苷色譜峰均達(dá)到基線分離，哈巴俄苷含量測(cè)定結(jié)果基本一致，方法耐用性良好。