健脾益氣合劑質量標準提升研究*

陳 朝，陳小媛，黃 敏，黃曉燕，韋家歡，楊正騰

（廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023）

健脾益氣合劑是我院研發的傳統中藥制劑（桂藥制字Z01060070），由黃芪、黨參、陳皮、何首烏、白術、麥冬等中藥組方，可有效改善反復呼吸道感染患兒的臨床癥狀、體征及免疫狀態，在防治小兒反復呼吸道感染及治療脾虛型厭食癥方面已取得滿意療效［1-3］。健脾益氣合劑現行質量標準僅有相對密度及合劑項下規定的檢查項，無專屬性鑒別項與含量測定項，對該制劑的質量控制較弱。本研究中增加了黃芪、何首烏、白術、陳皮的薄層色譜（TLC）法，以陳皮有效成分橙皮苷作為含量測定指標，建立了專屬性較強的高效液相色譜（HPLC）法，可為完善和提高該制劑的質量標準提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀；美國Waters 2998 型檢測器（美國Waters 公司）；YOKO-CS 型紫外線透射反射成像儀（武漢藥科新技術開發有限公司）；GH-25型電子分析天平（日本A&D 公司，精度為萬分之一）；CD-UPT 型超純水機（成都越純科技有限公司）；毛細管（國藥控股有限公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠，規格為10 cm×10 cm）。

1.2 試藥

健脾益氣合劑（廣西中醫藥大學第一附屬醫院制劑室，批號為20170819，20180122，20180515）；黃芪甲苷對照品（批號為110781-200613），橙皮苷對照品（批號為110721-201316），大黃素對照品（批號為110756-201512），制何首烏對照藥材（批號為121454-201405），白術對照藥材（批號為120925-200708），陳皮對照藥材（批號為120969-201510），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

黃芪［4］：取本品20 mL，用水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌3 次，每次20 mL，棄去堿液，合并正丁醇液，再用正丁醇飽和的水洗至中性，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。按處方工藝取缺黃芪藥材的陰性樣品20 mL，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。分別吸取上述對照品溶液5 μL、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-水（20 ∶10 ∶11 ∶5，V/ V/ V/ V）10 ℃以下放置30 min 的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光（365 nm）燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。結果見圖1 A（溫度為26 ℃，相對濕度為65%，展距為7.0 cm）。

圖1 薄層色譜圖

制何首烏［5］：取本品20 mL，用乙酸乙酯振搖提取3 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。按處方工藝取缺制何首烏藥材陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取制何首烏對照藥材0.5 g，加甲醇30 mL，超聲提取30 min，濾過，蒸干，殘渣加水20 mL 使溶解，同法制備對照藥材溶液。取大黃素對照品0.5 g，加甲醇1 mL，作為對照品溶液。分別吸取大黃素對照品溶液2 μL、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μL、制何首烏對照藥材溶液4 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30 ～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（14 ∶2 ∶1，V/V/ V）為展開劑，展開，取出，晾干。供試品溶液色譜中，在與對照品及對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點。結果見圖1 B（溫度為25 ℃，相對濕度為60%，展距為7.0 cm）。

白術［6］：取本品20 mL，用乙酸乙酯振搖提取2 次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，30 mL 水洗滌，乙酸乙酯液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。按處方工藝取缺白術藥材陰性樣品20 mL，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取白術對照藥材2 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，同法制備對照藥材溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 中TLC 法試驗，分別吸取供試品溶液、陰性對照品溶液各2 μL、對照藥材溶液1 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸（10 ∶1 ∶0.1，V/ V/ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%氫氧化鈉溶液，于365 nm 波長下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。結果見圖1 C（溫度為27 ℃，相對濕度為55%，展距為7.5 cm）。

陳皮［7-8］：取本品20 mL，用乙酸乙酯振搖提取3 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方工藝取缺陳皮藥材的陽性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。取陳皮對照藥材1 g，加水60 mL，煮沸30 min，濾過，濾液濃縮成20 mL，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取橙皮苷對照品1.7 mg，加甲醇1 mL，振蕩30 s，4 ℃靜置過夜，取上清液，即得橙皮苷對照品飽和溶液，作為對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 中TLC 法試驗，分別吸取供試品溶液、陰性對照品溶液、對照品溶液、對照藥材溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100 ∶17 ∶13，V/ V/ V）為展開劑，展至約8 cm，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁溶液，置紫外光（365 nm）燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液、對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。結果見圖1 D（溫度為26 ℃，相對濕度為60%，展距為8.0 cm）。

2.2 橙皮苷含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：WondaCract ODS-2 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（20 ∶80，V/ V）；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：285 nm。

2.2.2 溶液制備

取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含50 μg 的溶液，即得對照品溶液。精密量取本品1 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾（0.45 μm），即得供試品溶液。按處方工藝取除陳皮外的其他藥味，依法制備陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取橙皮苷對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液，分別進樣測定，記錄色譜圖（見圖2）。結果橙皮苷的保留時間約為21.45 min，陳皮陰性對照品溶液的色譜圖中在橙皮苷的位置無吸收峰，表明方法專屬性強。

線性關系考察：取橙皮苷對照品3.8 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。精密吸取0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為7.6，15.2，30.4，60.8，91.2，121.6 μg/mL 的對照品溶液。分別吸取10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定峰面積，每個樣品測定2 次，取平均值。以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=1.561 8×104X-1.486 3×104，r=1.000 0（n=6）。結果表明，橙皮苷質量濃度在7.6 ～121.6 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取橙皮苷對照品溶液，按擬訂色譜條件重復進樣6 次，測定峰面積。結果橙皮苷峰面積的RSD為0.45%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖2 高效液相色譜圖

穩定性試驗：取同一供試品溶液（批號為20180515），室溫放置，分別于0，1，5，12，24，48 h 時進樣測定。結果橙皮苷峰面積的RSD為0.86%（n=6），表明供試品溶液在48 h 內穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為20180515）樣品，依法制備供試品溶液共6 份，每份進樣測定2 次。結果橙皮苷含量的RSD為0.65%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取樣品（批號為20180515）1 mL，共8 份，分別精密加入0.47 mg/mL 的橙皮苷對照品溶液各1 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 橙皮苷加樣回收試驗結果（n=8）

2.2.4 樣品含量測定

取 3 批（ 批 號 分 別 為 20170819，20180122，20180515）樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定橙皮苷含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（mg/mL，n=3）

3 討論

多組分、多指標的質量控制體系的意義：民族藥制劑現階段整體質量標準水平較低，仍多集中于藥材基源及鑒定的研究，并未充分利用現代分離分析技術和方法對其物質基礎進行深入探討，多數尚未建立多組分、多指標的質量控制體系，嚴重制約了民族醫藥的發展［9］。2016年，健脾益氣合劑被確認為《廣西醫療機構中藥民族藥制劑標準（第一卷）》擬收載質量標準提高的品種。本研究中對該制劑進行深入研究，提高并擬訂了新的質量標準。

指標成分選擇：陳皮理氣健脾，為健脾益氣合劑的主藥，而橙皮苷是陳皮的主要活性成分，故選擇橙皮苷作為含量測定指標成分。橙皮苷為醇溶性成分［10］，且在甲醇中的溶解性優于乙醇［11］。健脾益氣合劑為液體制劑，故供試品溶液制備方法采用甲醇直接稀釋法，待測峰無雜質干擾，分離度好，加樣回收率高。

展開劑選擇：2015年版《中國藥典（一部）》中陳皮［6］的薄層層析法采用二次展開方法且含用甲苯，操作較復雜。因此，考察了三氯甲烷-甲醇-水（65 ∶35 ∶10，V/V/ V）［7］和三氯甲烷-丙酮-甲醇-冰醋酸（5 ∶1 ∶1 ∶0.02，V/ V/ V/ V）［8］2 種展開系統，發現斑點均不夠清晰。以乙酸乙酯-甲醇-水（100 ∶7 ∶13，V/ V/ V）為展開劑后，最終斑點清晰，操作簡單，且避免了甲苯和氯仿有害試劑的使用。

流動相選擇：多采用乙腈（甲醇）-磷酸（醋酸）-水系統。本研究中經對比考察，最終篩選出分離效果好、基線平穩、保留時間適中的乙腈-水（含0.1%磷酸溶液）系統作為流動相。曾考察不同儀器（島津LC -20A、Waters 2695）、不同色譜柱（Wonda Sil C18Super，WondaCract ODS-2）、不同柱溫（25，30，35 ℃）和不同流速（0.8，1.0，1.2 mL/min）對橙皮苷含量測定的影響，結果各色譜條件下的RSD均小于3.00%，分離效果理想，表明方法耐用性好。

吸收波長選擇：取橙皮苷對照品溶液適量，在波長210 ～400 nm 范圍內掃描，結果顯示，橙皮苷于285 nm波長處有最大吸收，因此選擇285 nm 作為檢測波長。

綜上所述，在健脾益氣合劑現行質量標準基礎上，增加了黃芪、制何首烏、白術、陳皮的TLC 鑒別及有效成分指標橙皮苷的含量測定，方法簡單易行，高效快速，質量可控，為完善和提升其質量標準提供了依據。