高效液相色譜法測定藏藥八味阿魏丸中沉香四醇含量*

尼珍，巴桑卓嘎，德白啦，達娃卓瑪

（西藏自治區食品藥品檢驗研究院·西藏自治區藏藥標準化研究重點實驗室，西藏 拉薩 850000）

八味阿魏丸是藏醫臨床習用藏藥，現為醫療機構制劑，是由阿魏、沉香、豆蔻、丁香、藏茴香、木香、當歸、羊腦漿和苦奎組方的復方制劑，具有調和“培龍”、溫補氣血功效，用于“培龍”病引起的頭痛、頭暈、失血性貧血、腦供血不足、腦缺氧等癥［1］。處方中含阿魏酸、木香烴內酯、沉香四醇、去氫木香烴內酯、山姜素、丁香酚等化學成分。君藥阿魏的指標成分阿魏酸也是當歸中的指標成分，存在干擾；沉香為臣藥，占處方組分的17.5%，沉香四醇等2-（2-苯乙基）色原酮類化合物為沉香中主要藥效成分之一，有抗過敏、溫中止嘔、行氣止痛、抗氧化損傷等功效［2］，常用于治療寒性胃痛、老年性腸梗阻等胃腸道疾病［3］，同時是名貴天然香料［4］。目前，八味阿魏丸尚無國家或地方藥品標準，為使藥品的質量可控，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中的有效成分沉香四醇的含量?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters1525 型液相色譜儀（配DAD 檢測器、Empower 工作站，美國Waters 公司）；KQ-50B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；CPA225D 型Sartorius 電子天平（德國賽多利斯公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

沉香四醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111980-201602，供含量測定用）；八味阿魏丸（來源見表1），置干燥器中備用；甲醇和乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

表1 10 批八味阿魏丸樣品來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（28 ∶72，V/ V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：38 ℃；檢測波長：252 nm。理論板數按沉香四醇峰計應不低于4 000。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取沉香四醇對照品約1.2 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，用無水甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖1 沉香四醇的高效液相色譜圖

供試品溶液：取本品粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60% 甲醇10 mL，密塞，稱定質量，浸泡0.5 h，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）60 min，放冷，再稱定質量，用60% 甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：將八味阿魏丸處方中除沉香外的藥材粉末同處方量比例配成陰性對照品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：吸取2.2 項下3 種溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并用二極管陣列檢測器在200 ～500 nm波長范圍內對峰進行確證。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應峰，且為同一物質，而陰性對照無干擾。結果見圖1。

線性關系考察：以無水甲醇為溶劑，精密配制12.4，24.8，37.2，62.0，99.2，124.0 μg/mL 系列質量濃度的對照品溶液，分別進樣10 μL，按擬訂色譜條件進樣分析，以沉香四醇質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=31556X+11112，R2=0.999 6（n=6）。結果表明，沉香四醇質量濃度在12.4 ～124 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續測定6 次。結果的RSD為1.68% （n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：稱取同一編號（編號2）樣品6 份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果的RSD為1.59%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一編號（編號3）樣品，依法制備供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，10 h 時進樣測定。結果的RSD為1.42% （n=6），表明供試品溶液在10 h 內穩定。

耐用性試驗：取同一編號（編號5）樣品，依法制備供試品溶液，分別用2 個不同品牌（Waters1525 型和Agilent1260 型）的高效液相色譜儀進行測定。結果的RSD為1.18%，表明方法耐用性較好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（編號為5，沉香四醇的含量為0.239 mg/g）約1.143 g，精密稱定，共9份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液（含沉香四醇的量為樣品中沉香四醇含量的80% ，100% ，120% ）各3 份，再精密加入60%無水甲醇10 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣，計算回收率。結果見表2。

表2 沉香四醇加樣回收試驗結果（n=9）

2.4 樣品含量測定

取收集到的樣品共10 批，依法制備供試品溶液，各吸取10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果編號1 ～10樣品中沉香四醇含量分別為0.099，0.100，0.014，0.246，0.239，1.540，1.540，0.006，0.004，0.003 mg/g（n=2）。

3 討論

3.1 提取方法考察

取本品粉末約1.0 g，共2 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無水甲醇10 mL，密塞，稱定質量，浸泡0.5 h，分別超聲處理、回流提取60 min，放冷，再稱定質量，用無水甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。按擬訂色譜條件進行測定，結果回流法和超聲法對沉香四醇的提取效率相當，但超聲法提取簡便、耗能少、環保，故選擇超聲提取。

3.2 提取溶劑考察

取本品粉末約1.0 g，共4 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入無水甲醇、無水乙醇、30%甲醇、60%甲醇各10 mL，密塞，稱定質量，浸泡0.5 h，超聲處理60 min，放冷，再稱定質量，用各自溶劑補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。按擬訂色譜條件進樣測定，結果60%甲醇對供試品溶液中沉香四醇的提取效果較好，故以60%甲醇作為提取溶劑。

3.3 流動相考察

參考相關質量標準方法［5］，分別考察了乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫）、甲醇-0.1%甲酸（30 ∶70，V/ V）、甲醇-水（25 ∶75，V/ V）、甲醇-水（28 ∶72，V/ V）等流動相，結果以甲醇-水（28 ∶72，V/ V）為流動相時，沉香四醇峰形對稱、尖銳，理論板數達6 000 以上，分離度R大于1.5。

3.4 柱溫考察

分別考察了30，38，40 ℃3 個柱溫下供試品溶液的色譜峰情況，結果在3 個柱溫條件下，其色譜峰分離均良好，但隨柱溫的升高，其色譜峰的保留時間逐漸減小。從縮短分析時間和節約能源的角度考慮，選擇柱溫為38 ℃。

3.5 色譜柱考察

分別考察了Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）及Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）2 個品牌的色譜柱，結果沉香四醇色譜峰在Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）中分離效果較好。