洗四方袋泡劑質量標準研究*

黃振忠，袁經權，唐炳蘭，潘 宇，周陽曉，陳 路△

（1. 廣西壯族自治區貴港市中西醫結合骨科醫院，廣西 貴港 537100； 2. 廣西壯族自治區藥用植物園，廣西 南寧 530023； 3. 廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001）

洗四方袋泡劑是廣西壯族自治區貴港市中西醫結合骨科醫院臨床使用30 多年的驗方，作為治療骨科損傷疾病后期功能康復的外用熏洗協定方劑，具有活血化瘀、舒筋通絡功效。洗四方袋泡劑由雞血藤、大黃、三叉苦、白背葉、雞骨香等11 味中藥組方，用于骨科損傷疾病后期的功能康復、軟組織損傷、腰腿痛及手足凍瘡等的治療［1-2］。方中雞血藤為君藥，行血補血，通經活絡；白背葉、雞骨香散瘀止痛，祛風活血［3］；三叉苦消腫止痛［4］；大黃涼血、祛瘀、解毒［5］。該制劑在提取工藝、臨床用藥的安全性等方面均有報道［6-8］，為控制其質量，確保臨床用藥有效，本研究中通過薄層色譜（TLC）法定性鑒別該制劑中的雞血藤、三叉苦和大黃藥材，采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中大黃酸的含量，以期為該制劑質量標準的建立提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VARIAN 210 型高效液相色譜儀（UV 檢測器，美國瓦里安公司）；BSA124S 型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司，精度為0.1 mg）；SB-5200D 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；UV-1240 型紫外可見分光光度計（日本Shimadzu UV 公司）；ZF-8 型暗箱式四用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.2 試藥

雞血藤對照藥材（成都普菲德生物技術有限公司，批號為170621）；三叉苦對照藥材（批號為121682-201301），大黃對照藥材（批號為120984-201202），大黃酸對照品（批號為110757-201607），均購自中國食品藥品檢定研究院；雞血藤（批號為180601），三叉苦（批號為180401），大黃（批號為180701），均購自廣西玉林市至真中藥飲片有限責任公司；洗四方袋泡劑（批號分別為201810，201811，201812），廣西壯族自治區貴港市中醫結合骨科醫院院內制劑；甲醇、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜（TLC）鑒別

三叉苦：取3 批樣品各5 g，加95%乙醇50 mL，加熱回流1 h，冷卻，濾過，濾液蒸干，加水40 mL，超聲處理20 min，過濾，用醋酸乙酯萃取2 次，每次20 mL，合并2 次醋酸乙酯液，水浴蒸干，殘渣加甲醇2 mL 使溶解，作為供試品溶液；取三叉苦藥材粉末1 g，按供試品溶液制備方法制備供試藥材溶液，取三叉苦對照藥材粉末1 g，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液；取缺三叉苦的陰性樣品5 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述4 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸-水（5 ∶5 ∶1 ∶0.5，V/ V/ V/ V）為展開劑［10］，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同亮藍色斑點，陰性對照無干擾（見圖1 B）。

大黃：取3 批樣品各2 g，加水40 mL 回流提取1 h，冷卻，濾過，濾液加醋酸乙酯萃取3 次，每次20 mL，合并3 次醋酸乙酯萃取液，水浴蒸干，殘渣加乙醇2 mL 使溶解，作為供試品溶液；取大黃酸對照品0.001 0 g，精密稱定，加乙醇1 mL 制成質量濃度為1 mg /mL 的大黃酸對照品溶液；取大黃藥材粉末0.1 g，按供試品溶液方法制備供試藥材溶液，取大黃對照藥材粉末0.1 g，按供試品溶液方法制備對照藥材溶液；取缺大黃的陰性樣品2 g，按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述5 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠H 薄層板上，以現配的石油醚（60 ～90 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（11 ∶6 ∶1，V/ V/ V）上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。在254 nm 波長的紫外燈下檢視，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同棕色斑點，陰性對照無干擾［5，11］（見圖1 C）。

圖1 薄層色譜圖

圖2 高效液相色圖譜

2.2 大黃酸含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠Agilent XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（80 ∶20，V/ V）；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，理論板數按大黃酸峰計應不低于3 000。

2.2.2 溶液制備

取大黃酸對照品4.4 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得質量濃度為44 μg/mL的對照品貯備液；精密移取對照品貯備液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得質量濃度為22 μg/mL 的對照品溶液。取樣品3 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，精密加入25 mL 甲醇，密閉加塞，稱定質量，回流提取1 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，精密吸取續濾液10 mL 置燒瓶中，水浴揮去溶劑，加入10 mL 8%鹽酸溶液，超聲處理2 min，再加入10 mL 三氯甲烷，回流提取1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌圓底燒瓶，一同并入分液漏斗中，振搖，混合均勻，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3 次，每次10 mL，合并三氯甲烷層，水浴蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液［5］。另按處方工藝取缺大黃的陰性樣品3 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取2.2.2 項下對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。結果顯示，大黃酸色譜峰分離效果良好，且陰性對照無干擾。

線性關系考察：分別精密吸取對照品貯備液（質量濃度為44 μg/mL）1，2，3，4，5，6，7，8 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經微孔濾膜濾過，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以大黃酸進樣量（X，μg）為橫坐標、色譜峰峰面積值（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=89.306X+2.500，R2=0.999 7（n=8）。結果表明，大黃酸進樣量在0.044 ～0.352 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

2)采用模糊控制理論，設計MSJ5.8/1.6D型礦山豎井掘進機的偏斜控制系統，能夠針對豎井掘進機的偏斜特點進行合理的糾偏操作。通過試驗，證實了控制系統的可靠性。良好的糾偏能力不僅減少了豎井掘進機的鉆進、支護等建井成本，還提高了井壁質量，本系統在實際的豎井掘進機鑿井工程中有著廣闊的應用前景。

精密度試驗：精密吸取2.2.2 項下大黃酸對照品溶液（質量濃度為22 μg / mL）適量，按擬訂色譜條件連續重復進樣6 次，依法測定，記錄峰面積。結果大黃酸峰面積的RSD為0.99%（n =6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液（批號為201810），分別于0，1，2，4，8，12，24 h 時進樣測定，記錄峰面積。結果大黃酸峰面積的RSD為0.89%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為201810）樣品適量，精密稱定，依法平行制備6 份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果大黃酸平均含量為0.160 4 mg/g，RSD為1.64%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取9 份已知含量的樣品（批號為201810，大黃酸為0.160 4 mg/g）適量，依次精密加入對照品貯備液3，6，9 mL，各3 份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結果見表1。

表1 大黃酸加樣回收試驗結果（n=9）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批（批號分別為201810，201811，201812）樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算大黃酸含量。結果3 批樣品中大黃酸含量分別為0.160 4，0.162 5，0.138 2 mg/g。

3 討論

3.1 薄層色譜條件優化

雞血藤：供試品溶液制備時采用乙醇為超聲提取溶劑，但效果不理想，將超聲提取溶劑改成甲醇后，斑點濃度較大，清晰可見，分離好，陰性對照無干擾［3］；選擇二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸（8 ∶1.2 ∶0.3 ∶0.5，V/ V/V/ V）作為展開劑［3］，但結果Rf值較小且斑點拖尾，通過系統考察，選取環己烷-甲酸乙酯-冰醋酸-甲酸-異丙醇（5 ∶5 ∶0.5 ∶0.5 ∶1，V / V / V / V / V）作為展開劑［9］，分離效果較好；香草醛鹽酸溶液為顯色劑，結果斑點清晰，但顯色后斑點消失太快，后改進為顯色劑現用現配，斑點保留時間較久。

三叉苦：對供試品溶液的提取溶劑、提取方法做了系統考察［12-14］，結果采用95%乙醇提取的方法，斑點分離清晰，陰性對照無干擾；展開劑選擇甲苯-醋酸乙酯-甲酸-水（5 ∶5 ∶1 ∶0.5，V/ V/ V/ V）［10］，結果斑點不清晰，改成展開劑靜置30 min 后，取上層溶液，置紫外光燈（254 nm）下進行檢視，結果分離效果佳，斑點清晰，陰性對照無干擾。

大黃：展開劑的選擇參考2015年版《中國藥典（一部）》中大黃藥材鑒別及文獻［11］的方法，先以石油醚（30 ～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15 ∶5 ∶1，V/ V/ V）為展開劑，但溶劑易揮發、易分層、展開時斑點稍有堆積；后將石油醚（30 ～60 ℃）改為石油醚（60 ～90 ℃），并將展開劑比例調為石油醚（60 ～90 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（11 ∶6 ∶1，V/ V/ V），現配現用，結果斑點分離效果好，Rf值適中，且無拖尾現象。故選擇石油醚（60 ～90 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（11 ∶6 ∶1，V/ V/ V）為展開劑。

3.2 檢測波長選擇

采用紫外可見分光光度計在190 ～600 nm 波長范圍內對大黃酸對照品溶液進行紫外光譜掃描，結果在254 nm 波長處有最大吸收峰。檢測波長確定為254 nm。

3.3 流動相選擇

由于洗四方袋泡劑含多種中藥，成分復雜，故需選擇合適的流動相進行分析。曾考察甲醇-0.1%磷酸溶液的流動相系統，甲醇-0.1%磷酸溶液（85 ∶15，V/ V）［5］時主峰與雜峰分離效果差；甲醇-0.1%磷酸溶液流動相為（75 ∶25，V/ V）［15］時保留時間過長；甲醇-0.1%磷酸溶液流動相為（80 ∶20，V/ V）時峰型好，峰面積合適，且與雜峰的分離效果好，均達到要求。故選擇后者。

3.4 色譜條件選擇

曾以DIKMA C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），ULTIMATE×B C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）及 Agilent XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對樣品溶液進行含量測定。以DIKMA C18柱和Agilent XDB -C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）測得樣品溶液的保留時間短，且大黃酸與前后峰分不開，故不被選擇；而ULTIMATE × B C18柱測得樣品溶液的保留時間較好，但峰型差，理論板數較低，故不被采納；而Agilent XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱測得樣品溶液中的大黃酸保留時間合適，且與前后雜質峰的分離度均大于4，峰型和分離度均良好，符合《中國藥典》的規定，故選用該色譜柱。

3.5 方法評價

曾對洗四方袋泡劑中雞血藤、三叉苦和大黃藥材進行TLC 鑒別，斑點清晰，供試品溶液與對照品溶液的斑點對應良好，陰性對照無干擾；以HPLC 法測定洗四方袋泡劑中大黃酸的含量，分離效果好，峰形良好，保留時間適宜，專屬性強，測定結果準確，在規定時間內測定方法穩定。本研究中所建立的方法可靠、準確，操作簡單，可確保產品的質量和療效，保證患者用藥安全。