高效液相色譜-蒸發光散射法測定鵝去氧膽酸及雜質熊去氧膽酸含量*

蔡 明，徐 倩，喬金為，鮑學梅，韓 嵐，彭代銀△

（1. 安徽中醫藥大學第二附屬醫院藥學部，安徽 合肥 230001； 2. 安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012）

鵝去氧膽酸（CDCA）又稱3α，7α-二羥基-5-β-膽烷酸，是從膽汁中提取的一種天然產物，具有降低膽固醇分泌、增加膽汁分泌、平喘、抗炎、免疫調節等功效［1-3］。目前，其臨床主要用于膽固醇型結石的治療［4-5］。其主要雜質為熊去氧膽酸（UDCA）。2015年版《中國藥典（一部）》中，以酚酞為指示劑，以氫氧化鈉為滴定液的酸堿滴定法可用于測定CDCA 或UDCA 原料藥含量，操作簡單，對儀器要求低，分析快捷，但專一性差，精密度低［6］。薄層掃描法也是CDCA 和UDCA 原料藥含量測定的常用方法，進樣量在0.598 ～3.588 μg 范圍內與峰面積線性關系良好，操作簡單、專屬性強，但精密度低［7-8］。由于CDCA 和UDCA 結構中共軛體系少，僅末端有紫外吸收，故不能采用常規的高效液相色譜（HPLC）法檢測器測定CDCA 或UDCA 的含量［9-11］，需通過柱前衍生引入紫外吸收基團，該方法衍生物穩定，靈敏度高，但操作煩瑣［12］。本研究中建立了測定CDCA原料藥含量及雜質UDCA 的高效液相色譜-蒸發光散射（HPLC-ELSD）法，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，包括自動進樣器、柱溫箱、UV 檢測器等（安捷倫科技＜中國＞有限公司）；ELSD-UM-3000 型蒸發光散射檢測器（徐州華納精密儀器有限公司）；AUW120D 型分析天平（島津企業管理＜中國＞有限公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

鵝去氧膽酸原料藥（佛山信航生物科技有限公司，批號分別為CDCA-170402，CDCA-170404，CDCA-170406，純度為95.0%）；鵝去氧膽酸對照品（批號為110806-201708，純度為97.0%），熊去氧膽酸對照品（批號為110755-201704，純度為98.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；水為雙蒸水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠填充C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-0.10%甲酸溶液（58 ∶10 ∶32，V/ V/ V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；ELSD 漂移管溫度：90 ℃；載氣（N2）流速：2.6 L/min；進樣量：30 μL。

2.2 溶液制備

取鵝去氧膽酸原料藥50 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加稀釋劑乙腈-水（40 ∶60，V/ V）至刻度，搖勻，即得供試品溶液。取20 mg CDCA 或20 mg UDCA 對照品，精密稱定，分別置10 mL 容量瓶中，分別加乙腈-水（40 ∶60，V/ V）稀釋至刻度，搖勻，即得CDCA 對照品溶液或UDCA 對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取供試品溶液、CDCA 對照品溶液、UDCA 對照品溶液、空白溶劑，按擬訂色譜條件進樣測定。結果，空白溶劑無干擾，各成分的分離度均不小于1.5，理論板數不小于15 000，原料CDCA、雜質UDCA 等分離度均良好，拖尾因子均小于1.10。色譜圖見圖1。

線性關系考察：精密量取2.2 項下CDCA 或UDCA對照品溶液0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005 mL，分別置1 mL 棕色容量瓶中，加乙腈-水（40 ∶60，V/ V）稀釋至刻度，搖勻，得系列標準液。按擬訂色譜條件對系列標準液進樣，得HPLC-ELSD 圖譜，測定峰面積。分別以CDCA 或UDCA 的進樣質量濃度的對數值（X）為橫坐標、峰面積的對數值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得鵝去氧膽酸線性回歸方程為Y鵝=1.415 8X鵝+3.551 9，R2=0.989 6，線性范圍為1.0 ～100.5 μg/mL；熊去氧膽酸線性回歸方程為Y熊=1.363 6X熊+3.504 4，R2=0.994 4，線性范圍1.0 ～103.2 μg/mL。

檢測限（LOD）、定量限（LOQ）確定：精密量取2.2 項下CDCA 或UDCA 對照品溶液適量，配比稀釋，按擬訂色譜條件進樣，分別以信噪比（S/ N）為3 ∶1 和10 ∶1 計算LOD 和LOQ。結果鵝去氧膽酸的LOD 為0.45 μg/mL，LOQ 為1.52 μg/mL；熊去氧膽酸的LOD 為1.14 μg/mL，LOQ 為3.79 μg/mL。

精密度試驗：按擬訂色譜條件，在標準曲線濃度范圍內，取同一批號的CDCA 對照品溶液與UDCA 對照溶液，重復進樣6 次，測定，記錄峰面積。結果UDCA 峰面積的RSD為0.27%（n=6），UDCA 峰面積的RSD為1.13%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取鵝去氧膽酸原料藥（批號為CDCA-170402），依法制備CDCA 供試品溶液，于0，2，4，6，8，10 h 時進樣測定。結果CDCA 和UDCA 的峰面積積分值的RSD分別為1.05%和1.98%（n=6），表明供試品溶液在10 h 內穩定。

重復性試驗：取鵝去氧膽酸原料藥（批號為CDCA-170402）6 份，依法制備供試品溶液，重復進樣6 次，測定。結果CDCA 平均質量含量和RSD分別為97.47%和0.12%（n=6），UDCA 平均質量含量和RSD分別為0.16%和1.57%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批已知含量的CDCA 和UDCA鵝去氧膽酸原料藥（批號為CDCA-170402）各9 份。分別加入CDCA 和UDCA 對照品適量，用乙腈溶解，加乙腈-水（40∶60，V/ V）稀釋成25mL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄圖譜，以外標法測定物質含量，計算回收率。結果見表1。

2.4 樣品含量測定

精密量取2.2 項下供試品溶液、CDCA 對照品溶液、UDCA 對照品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，采用外標法測定物質含量及其他雜質峰，結果見表2。

圖1 高效液相色譜-蒸發光散射圖譜

表1 加樣回收試驗結果（n=9）

表2 樣品含量測定結果（%，n=6）

3 討論

鵝去氧膽酸膠囊為臨床常用利膽藥，主要用于治療膽固醇性膽結石，其主要成分為鵝去氧膽酸。鵝去氧膽酸結構較復雜，合成步驟較多。因此，鵝去氧膽酸膠囊中難免會引入微量雜質，如熊去氧膽酸、膽石酸等。膽石酸等雜質可能會引發不良反應［13］。因此，控制鵝去氧膽酸膠囊的質量對于減少因臨床用藥導致的不良反應具有重要意義。

與薄層色譜法、酸堿滴定法相比，HPLC 法準確度和精密度較高，但目前常用的HPLC 法均需柱前衍生處理，操作復雜［14］。RP-HPLC 法可用于熊去氧膽酸膠囊中各成分的含量測定［15］。考慮到去氧膽酸為甾體化合物，無明顯的紫外吸收，故HPLC 檢測時無法采用常規的紫外檢測器。本研究中采用了HPLC-ELSD 法測定鵝去氧膽酸原料藥中主成分CDCA 及雜質UDCA 含量。

因CDCA 及雜質UDCA 等分子結構中含有羧基，分子極性較強，且能發生電離，為保證待測組分有足夠的C18保留能力，需在流動相中加入一定濃度的改良劑，使所有組分處于游離狀態。本研究中考察了不同甲酸體積分數對分析的影響，發現甲酸體積分數在0.05%以上時，對CDCA 和UDCA 峰的保留和各雜質的分離基本無影響，在考察到高酸度對C18色譜柱潛在的影響后，最終選擇0.1%甲酸作為本方法的pH 改良劑。進一步考察了水、乙腈、甲醇、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙腈-水等極性相對較大溶液與0.1%甲酸混合為流動相對CDCA 原料藥各成分的洗脫效果，最終選擇乙腈-甲醇-0.10%甲酸溶液（58 ∶10 ∶32，V/ V/ V）體系洗脫，效果好，且噪音小。方法學考察結果顯示，該方法系統適用性、重復性均較好，精密度、準確性高，可用于鵝去氧膽酸的質量控制。