小規格高濃度奧硝唑注射液無菌檢查方法學研究*

賈 萌，賀聰瑩，周志云，楊曉莉

（陜西省食品藥品監督檢驗研究院·藥品微生物檢測技術重點實驗室，陜西 西安 710065）

奧硝唑為第3 代硝咪唑類衍生物，其抗菌機制是通過分子中的硝基在無氧或少氧環境中被還原成氨基，從而抑制病原細胞DNA 的合成，并使已合成的DNA 降解，破壞DNA 的雙螺旋結構，阻斷轉錄及復制，使病原細胞徹底死亡［1-2］。其5 位上的硝咪唑環決定了這類藥物具有較強的抗菌和抗原蟲作用，尤其是具有較強的抗厭氧菌作用，如本研究中涉及的生孢梭菌。經調研，目前國內醫藥市場及西安市內三級甲等醫院［3］所用奧硝唑注射液的規格為每瓶100 mL ∶0.5 g，每支10 mL ∶0.5 g或每支5 mL ∶0.5 g，而每支3 mL ∶0.5 g 規格的奧硝唑注射液將來可能會在西安市內各大醫院使用，故對該規格奧硝唑注射液無菌檢查方法的研究勢在必行。從該藥新規格處方配比來看，其藥效和穩定性都大大提高，說明其抑菌性更強，無菌檢查方法的建立難度也隨之提升。本研究中擬探索出更科學高效的小規格高濃度奧硝唑注射液的無菌檢查方法，以便后期對醫藥企業建立該規格樣品的無菌檢查方法時提供參考。現報道如下。

1 儀器、試藥與菌株

1.1 儀器

Steritest Symbio LFH 型智能集菌儀（德國Merck 公司）；SX-500 型蒸汽滅菌器（Tomy 公司）；LRH-250 型生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；WGP-600型隔水式電熱恒溫培養箱（重慶萬達實驗儀器廠）；HFsafe-760S 型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；PB-10 pH 計（德國Sartorius 公司）；渦旋振蕩儀（德國IKA 公司）；單項溶解組件（雙針頭溶解組件）、KSF220 型一次性全封閉集菌培養器［4］均購自浙江泰林生物技術設備有限公司。

試藥：奧硝唑注射液（規格為每支3 mL∶0.5g 供試品，研制品）；硫乙醇酸鹽流體培養基（FTM，批號為180830），胰酪大豆胨液體培養基（TSB，批號為180524），胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，批號為180427），沙氏葡萄糖液體培養基（SDB，批號為180731），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號為180518），0.1%蛋白胨水溶液（批號為181028），均購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.3 菌株

金黃色葡萄球 菌Staphylococcus aureus〔CMCC（B）26003〕，銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa〔CMCC（B）10104〕，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis〔CMCC（B）63501〕，生孢梭菌Clostridium sporogenes〔CMCC（B）64941〕，大腸埃希菌Escherichia coli〔CMCC（B）44102〕，白色念珠菌Candida albicans〔CMCC（F）98001〕，黑曲霉Aspergillus niger〔CMCC（F）98003〕，均購自中國醫學細菌保藏管理中心，工作用菌株為第3代［5］。

2 方法與結果

2.1 試驗菌制備

分別將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種于TSB 培養基中，35 ℃條件下培養24 h；生孢梭菌接種于FTM 培養基中，35 ℃條件下培養24 h；白色念珠菌接種于SDB 培養基，25 ℃條件下培養48 h；黑曲霉接種于SDA 培養基中，25 ℃條件下培養7 d。上述菌株均分別加入含0.05%聚山梨酯80 的無菌氯化鈉溶液，洗脫孢子，采用10 倍稀釋法制得每1 mL 含菌數小于100 cfu 的菌懸液［5-6］。加入菌株稀釋級及含菌數計數結果見表1。

表1 菌株稀釋級及含菌計數結果

2.2 無菌方法適用性研究

試驗Ⅰ組：取供試品20 支，無菌操作，開啟集菌儀，先用0.1%蛋白胨水溶液50 mL 潤洗濾膜，再將供試品導入集菌過濾器內，每支供試品接入每種培養基的量為1.5 mL（即半量接入），每膜接種供試品30 mL（20 支）。按薄膜過濾法過濾，用0.1%蛋白胨水溶液沖洗5 次，每次100 mL，最后1 次沖洗液預留少許加入含菌量小于100 cfu 的試驗菌株，過濾，在每個培養管內灌注培養基100 mL。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和生孢梭菌接種于FTM 培養基中，35 ℃條件下培養5 d，枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉接種于TSB 培養基中，25 ℃條件下培養5 d［7］。

試驗Ⅱ組：僅沖洗液中加入0.5%聚山梨酯80，其余操作同試驗Ⅰ組［7］。

試驗Ⅲ組：僅最終的FTM 和TSB 培養基中加入0.5%聚山梨酯80，其余操作同試驗Ⅰ組。

試驗Ⅳ組：在沖洗液及最終的FTM 和TSB 培養基中加入0.5%聚山梨酯80，其余操作同試驗Ⅰ組。

試驗Ⅴ組：僅沖洗液中加入1%聚山梨酯80，其余操作同試驗Ⅰ組。

試驗Ⅵ組：沖洗液中加入1%聚山梨酯80，沖洗后再用0.1%蛋白胨水溶液200 mL（每次50 mL）沖洗4 次，去除泡沫，其余操作同試驗Ⅰ組。

試驗Ⅶ組：僅沖洗次數增至8 次，其余操作同試驗Ⅵ組。

試驗Ⅷ組：取供試品20 支，無菌操作，開啟集菌儀，用無菌的單項溶解組件將供試品（每支半量）導入含1%聚山梨酯80 的0.1%蛋白胨水溶液（每瓶200 mL）中，混勻，待用。用0.1%蛋白胨水溶液潤膜，將上述制備好的稀釋樣液按薄膜過濾法過濾，用含1%聚山梨酯80 的0.1%蛋白胨水溶液沖洗5 次，每次100 mL，再用0.1%蛋白胨水溶液200 mL 沖洗，4 次，每次50 mL，去除泡沫，其余操作同試驗Ⅰ組。

陽性對照組：不加入供試品，以生孢梭菌為陽性對照菌，操作同試驗Ⅰ組。

陰性對照組：取相應稀釋液、沖洗液同試驗Ⅰ組操作，不加入供試品和試驗菌。

2015年版《中國藥典（四部）》通則1101 無菌檢查法項下規定，與陰性對照組培養管比較，各試驗組與陽性對照組的試驗菌均生長良好或培養管混濁，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可忽略不計，按此法進行供試品的無菌檢查。若試驗組的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明該供試品的該檢驗量在該檢驗條件下的抑菌作用未消除，應采取增加沖洗量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，重新進行方法適用性試驗［5-6］。

2.3 試驗結果

結果見表2。陽性對照組中均生長良好（全部培養管均混濁）；試驗Ⅰ組中6 種試驗菌株的培養管中均未出現混濁；試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組中白色念珠菌和黑曲霉培養管均混濁，而其余菌均未生長；試驗Ⅳ組中枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉培養管均混濁，其余菌均未生長；試驗Ⅴ組中由于過濾過程中產生泡沫，最后灌注培養基后金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和生孢梭菌培養管不易觀察，枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉混濁很明顯；試驗Ⅵ組中金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉培養管均混濁，生孢梭菌培養管在第5 天出現混濁，濁度較陽性對照組輕；試驗Ⅶ組培養管均混濁（生孢梭菌培養管第3 天變混濁），濁度與陽性對照組相近；試驗Ⅷ組培養管均混濁（生孢梭菌培養管第2 天混濁）。

表2 小規格（3 mL ∶0.5 g）奧硝唑注射液無菌檢查方法學試驗結果

3 討論

抗菌藥物無菌檢查方法學的建立重點在于抑菌性的去除，而不同類別的抗菌藥物由于其藥理機制不同，對不同敏感菌的抑制作用也各不相同［8］。不同規格的同種抗菌藥物其抑菌作用也千差萬別［9］，建立合適的無菌檢查方法對于醫藥企業的檢驗工作可起到事半功倍的效果。本次供試品規格屬于新藥，其對厭氧菌的抑制能力強于其他規格。

試藥處方：本次供試品處方僅含奧硝唑主藥、無水乙醇及丙二醇［2］，處方中無水乙醇及丙二醇可增強奧硝唑在有機溶劑中的穩定性。丙二醇是一種無色黏稠狀透明液體，在進行薄膜過濾法無菌檢查方法學研究時，對比了直接吸取過濾和稀釋供試品后再過濾對試驗過程及結果的影響［10］，經過8 組試驗結果的確認，最終選擇稀釋法進行樣品的前處理，既降低了供試品的抑菌性，又方便了過濾。

中和劑選擇：奧硝唑為第3 代硝咪唑類化合物，其分子結構中的硝咪唑環決定了其抑菌能力，5 位上硝咪唑環中的氮原子屬季銨化合物，銨根離子（NH4+）中的4 個H 均被其他基團替代。由于其含有季銨結構，可選用聚山梨酯類非離子表面活性劑為中和劑。聚山梨酯80 是多元醇型非離子表面活性劑，親水性強，常用作增溶劑和穩定劑［11］。經試驗確定，中和劑選擇聚山梨酯80。

中和劑用量：在使用過程中，由于薄膜過濾器內部壓力和聚山梨酯80 所處環境溫度的影響（當環境溫度低于其自身曇點溫度時會有不穩定的起泡現象發生），加入中和劑的沖洗液在過濾過程中有較多泡沫產生［7］，為了后期便于觀察，最后需用不含聚山梨酯80 的0.1%蛋白胨水溶液沖掉泡沫的干擾。試驗過程中比較了不加中和劑、加入0.5%聚山梨酯80 和加入1%聚山梨酯80 對試驗結果的影響，結果顯示，沖洗液中加大中和劑的濃度可適當降低奧硝唑的抑菌性，但聚山梨酯80 的含量超出1%后濾管內會產生大量泡沫，導致不易觀察和操作，因此在無菌檢查方法的建立中，選用沖洗液中和劑的用量［12］為1%聚山梨酯80。試驗Ⅶ組與試驗Ⅷ組的結果均滿足奧硝唑注射液無菌檢查方法學的要求，但試驗Ⅶ組在樣品黏稠問題上未得到合理解決，試驗過程中由于樣品黏稠不易過濾，極易導致交叉污染的風險，且2015年版《中國藥典（四部）》通則1101 無菌檢查法項下薄膜過濾法部分明確規定，每張濾膜每次沖洗量一般為100 mL，且總沖洗量不得過1 000 mL，以避免濾膜上的微生物受損［5-6］。因此，選擇試驗Ⅷ組條件為最終方案。

綜上所述，本研究中建立的稀釋-中和劑薄膜過濾法可對小規格高濃度（3 mL ∶0.5 g）奧硝唑注射液進行無菌檢查。