蘿卜硫素對宮頸癌HeLa 細胞凋亡及放射敏感性的影響

張亞芳，趙曉紅，王德珠，張華鳳，王小花

（海南省婦女兒童醫學中心婦產科，海南 海口 570206）

放射治療（簡稱放療）是治療中晚期宮頸癌的主要手段，可實現宮頸癌的局部控制。但在宮頸癌的治療中，耐放射治療越來越受到重視，因其是放療臨床失敗的原因之一［1］。但這種腫瘤耐輻射的分子機制尚不完全清楚。腫瘤細胞在細胞周期的G2/M 期對放射最敏感，在S 期對放射最耐受［2］。放療可激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（AKT），這些通路調節細胞的增殖和凋亡，抑制這些途徑可增強細胞的放射敏感性［3］。流行病學研究表明，經常食用水果和蔬菜對癌癥的發展具有抑制作用［4］。蘿卜硫素廣泛存在于西蘭花、卷心菜、花椰菜、甘藍、蘿卜、芥菜等十字花科植物中，在體外可抑制包括人結腸癌、白血病和前列腺癌細胞在內的幾種癌細胞系的增殖，并增加其凋亡［5］。蘿卜硫素還可誘導G2/M 期細胞周期停滯，降低S 期細胞的百分比，抑制體外癌細胞的組蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性，并在體內延遲前列腺癌（PC-3）異種移植瘤的生長［6］。此外，蘿卜硫素和其他藥物聯用可進一步抑制細胞生長，從而使藥物和放療劑量降低到比單用時更安全的水平，以確保更低的癌癥發生率和不良反應等級［7］。本研究中觀察了蘿卜硫素對HeLa 細胞凋亡及體外放射的增敏作用，為宮頸癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：MK3 型酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；Clinae 23EX 型直線加速器（美國Varian 公司）；Ti-s 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；BD 垂直電泳儀，BD/FACSC anto Ⅱ流式細胞儀，均購自美國BD 公司；E-Gel Imager 型凝膠成像儀（美國UVP 公司）。

試藥：蘿卜硫素（純度大于99%，上海研生生化試劑有限公司）；RPMI-1640 培養基和胎牛血清（美國HyClone 公司）；胰酶和青鏈霉素溶液（美國Corning 公司）；四氮唑（MTT，美國Amresco 公司）；細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒（美國BD 公司）；細胞蛋白抽提試劑盒（碧云天生物技術研究所）；細胞外信號調節激酶（ERK1/2），磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2），Akt、磷酸化Akt（p-Akt），半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3），β-actin 抗體，均購自美國Santa Cruz 公司；辣根過氧化物酶HRP 標記親和純化山羊抗小鼠IgG 二抗（武漢艾美捷科技有限公司）。

細胞：宮頸癌HeLa 細胞（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）。

1.2 細胞培養

用含胎牛血清（10%）的RPMI-1640 培養液在37℃、5%CO2條件下培養HeLa 細胞，隔日換液，選擇對數生長期細胞進行試驗。

1.3 MTT 法檢測蘿卜硫素和放射線的生長抑制作用

將HeLa 細胞以5×103個/孔接種于96 孔板中（每孔200 μL），用不同濃度蘿卜硫素（0，10，20，40，80，160，320 μmol/L）或不同劑量放射線（0，1，2，4，6，8 Gy）干預24 h 后加入MTT（每孔50 μL），繼續培養4 h，離心，棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO），每孔200 μL，振蕩，用酶標儀在450 nm 波長處檢定吸光度值（OD值），計算細胞抑制率。細胞抑制率=OD對照組-OD處理組/OD對照組×100%。

1.4 克隆形成試驗觀察蘿卜硫素的放射增敏作用

將HeLa 細胞分為放射組和聯合組。取對數生長期的HeLa 細胞以103個/孔接種于6 孔板中（每孔3 mL），待細胞貼壁后，聯合組加入含有半數抑制濃度（IC50）的蘿卜硫素，放射組不加蘿卜硫素，同時用不同劑量放射線（0，1，2，4，6，8 Gy）照射24 h 后更換培養液，正常培養14 d，隔天換液。將細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，用甲醇固定，并用Giemsa 溶液染色。由2 名研究人員獨立在顯微鏡下手動計數至少包含50 個細胞的菌落數。計算細胞克隆形成率（PE）和存活分數（SF），PE=菌落形成數/接種數×100% ，SF=PE測試組/ PE對照組×100% 。應用GraphPad Prism 軟件5.01，按照SF=1-（1-eD/D0）N 公式生成劑量-生存曲線，并計算放射生物學參數，包括平均致死劑量（D0）、準致死劑量閾值劑量（Dq），臨床實踐中每日劑量2 Gy（SF2），外推數（N），D0時放射增敏比（SERD0）=D0對照組/D0實驗組；Dq時放射增敏比（SERDq） =Dq對照組/D0實驗組［8］。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期

將HeLa 細胞分為對照組、聯合組、蘿卜硫素組和放射組。對照組不進行處理，聯合組用含有IC50的蘿卜硫素和半數抑制劑量的放射線進行處理，蘿卜硫素組用含有IC50的蘿卜硫素處理，放射組用半數抑制劑量的放射線進行處理。將HeLa 細胞以5×104個/孔接種于6 孔板內（每孔3 mL），待細胞貼壁后，按上述分組分別處理HeLa 細胞24 h，棄培養基，消化后轉移至離心管內，離心，棄上清液，根據試劑盒說明書，用流失細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期。

1.6 蛋白質印跡（WB）法檢測蛋白表達

以5×104/孔接種于6 孔板內（每孔3 mL），待細胞融合加入，按1.5 項下方法分組，分別處理HeLa 細胞24 h，收獲細胞，根據細胞量加入細胞蛋白抽提液，進行電泳，每孔上樣量為20 μg，將印跡轉移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h，將膜與相應抗體進行孵育，4 ℃過夜，用TBST 緩沖液對膜進行2次沖洗，將二抗（1 ∶5 000）在室溫下孵育30 min。用ECL法顯色，采集圖像進行分析。

1.7 統計學處理

采用SPSS 19.0 統計學軟件分析。試驗結果采用均數±標準差（）表示，分析前進行正態檢驗，用單因素方差分析進行判斷，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蘿卜硫素對HeLa 細胞抑制作用的影響

隨著蘿卜硫素濃度的增加，HeLa 細胞抑制率增加，與0 μmol/L 比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。蘿卜硫素對HeLa 細胞的IC50為（76.28±9.27）μmol/L，故選80 μmol/L 作為干預濃度。詳見圖1。

2.2 放射線對HeLa 細胞抑制作用的影響

隨著放射線劑量的增加，HeLa 細胞抑制率增加，與0 Gy 比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。放射線對HeLa 細胞的半數抑菌劑量為（2.13±0.27）Gy，故選2 Gy作為半干預劑量（P＜0.05）。詳見圖2。

圖1 蘿卜硫素對HeLa 細胞抑制作用的影響

圖2 放射線對HeLa 細胞抑制作用的影響

2.3 蘿卜硫素對HeLa 細胞放射敏感性的影響

隨著放射劑量的增加，放射組和聯合組細胞存活率均降低，且聯合組各放射劑量的細胞存活率均低于放射組，差異有統計學意義（P＜0.05）。蘿卜硫素能提高HeLa 細胞的放射敏感性，SERD0和SERDq分別為1.517 和2.024。詳見表1 和圖3。

表1 劑量-生存曲線的放射生物學參數

2.4 蘿卜硫素對HeLa 細胞凋亡和細胞周期的影響

各組HeLa 細胞G0/G1期細胞比例變化不顯著，差異無統計學意義（P ＞0.05）；與對照組比較，其余各組HeLa 細胞凋亡和G2/M 期細胞比例增加，S 期細胞比例降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與蘿卜硫素組和放射組比較，聯合組HeLa 細胞凋亡和G2/M 期細胞比例增加，S 期細胞比例降低，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表2 和圖4、圖5。

圖3 蘿卜硫素對HeLa 細胞放射敏感性的影響

表2 蘿卜硫素對HeLa 細胞凋亡和細胞周期的影響（±s，%）

表2 蘿卜硫素對HeLa 細胞凋亡和細胞周期的影響（±s，%）

注：與對照組比較，a P＜0.05；與蘿卜硫素組比較，b P＜0.05；與放射組比較，c P＜0.05。

組別對照組蘿卜硫素組放射組聯合組細胞凋亡率1.95±0.13 3.12±0.18a 4.35±0.46ab 6.35±0.37abc G0/G1 62.51±4.28 60.07±4.58 60.38±7.59 62.48±6.73 S 25.95±2.06 22.29±3.17a 20.14±5.36ab 14.50±4.83abc G2/M 11.54±2.17 18.64±0.25a 19.48±3.54ab 23.02±4.92abc

2.5 蘿卜硫素對HeLa 細胞中ERK1/2，p-ERK1/2，Akt，p-Akt，Caspase-3 蛋白表達的影響

與對照組比較，其余各組HeLa 細胞中ERK1/2，p-ERK1/2，Akt，p-Akt，Caspase-3 蛋白表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與蘿卜硫素組和放射組比較，聯合組HeLa 細胞中ERK1/2，p-ERK1/2，Akt，p-Akt，Caspase-3 蛋白表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表3。

3 討論

圖4 蘿卜硫素對HeLa 細胞凋亡的影響

蘿卜硫素最早于1992年在花椰菜芽中被發現，是一種著名的抗癌化學預防劑，可抑制骨肉瘤細胞和其他惡性腫瘤的生長，其腫瘤抑制作用已在臨床試驗中被評估，包括前列腺癌患者的Ⅱ期試驗［9］。雖然蘿卜硫素的抗癌作用已在眾多研究中被報道，但其增強癌細胞放射敏感性的作用至今未被研究。同時，相比于其他化學治療（簡稱化療）藥物的高毒性和多種不良反應，大鼠口服有效劑量的蘿卜硫素后，其最大血藥濃度為20 μmol/L，但人類口服富含蘿卜硫素的西蘭花芽后，最大血藥濃度僅為2 μmol/L［10］。本研究結果顯示，蘿卜硫素對體外培養的HeLa 細胞增殖有抑制作用，且呈濃度依賴性。在克隆形成試驗中，與未加蘿卜硫素處理的細胞相比，蘿卜硫素處理細胞的放射敏感性呈劑量依賴性增加，表明蘿卜硫素可增強HeLa 細胞的放射敏感性。

圖5 蘿卜硫素對HeLa 細胞周期的影響

表3 蘿卜硫素對HeLa 細胞中ERK1 /2，p-ERK1/2，Akt，p-Akt，Caspase-3 蛋白表達的影響（±s）

表3 蘿卜硫素對HeLa 細胞中ERK1 /2，p-ERK1/2，Akt，p-Akt，Caspase-3 蛋白表達的影響（±s）

注：與對照組比較，a P＜0.05；與蘿卜硫素組比較，b P＜0.05；與放射組比較，c P＜0.05。

組別對照組蘿卜硫素組放射組聯合組ERK1/2 0.32±0.04 0.76±0.08a 0.91±0.05ab 1.38±0.27abc p-ERK1/2 0.28±0.04 0.62±0.05a 0.73±0.07ab 1.17±0.20abc Akt 0.75±0.09 0.81±0.10a 1.06±0.37ab 1.54±0.43abc p-Akt 0.22±0.03 0.28±0.02a 0.36±0.03ab 0.58±0.09abc Caspase-3 0.43±0.04 0.52±0.04a 0.68±0.05ab 0.82±0.09abc

細胞周期阻滯和凋亡被認為是蘿卜硫素最重要的作用機制［11］。研究表明，在細胞周期中，G2/M 期對放射最敏感［12］。因此，誘導細胞周期阻滯在G2/M 期的藥物在體內外都表現出了很強的放射敏感性。蘿卜硫素在人骨肉瘤U2OS 細胞中誘導G2/M 阻滯和凋亡［13］，在人骨肉瘤MG63 細胞中誘導生長阻滯，并以p53 獨立的方式上調p21WAF1/CIP1 蛋白的表達［14］。本研究中流式細胞術結果顯示，蘿卜硫素或（和）蘿卜硫素聯合放射可抑制G2/M 期細胞周期進展，誘導HeLa 細胞凋亡。但蘿卜硫素和放射的確切協同作用機制目前尚不清楚。據報道，激活ERK1/2 和Akt 激酶可使G2/M 期停止，增加細胞對放射誘導的細胞死亡敏感。但輻射抵抗可能是由于放射抑制ERK1/2 和Akt，導致腫瘤細胞動態快速適應，以維持生長和生存能力［15-16］。因此，ERK1/2 和Akt的激活可能增強腫瘤的放射敏感性。蘿卜硫素通過引起G2/M 期阻滯來抑制LM8 細胞的生長，表現為促進細胞Akt 和ERK1/2 的磷酸化，通過Caspase-3 的裂解和激活，調節細胞凋亡和細胞增殖［17］。在胰腺癌細胞中，蘿卜硫素通過抑制PI3K/Akt 和MEK/ERK 通路誘導細胞凋亡［18］。本研究結果顯示，蘿卜硫素增強了放射誘導的ERK1/2 和Akt 磷酸化，表明蘿卜硫素可增強HeLa細胞的放射敏感性。

綜上所述，蘿卜硫素通過G2/M 期阻滯誘導HeLa細胞凋亡，并通過ERK 和Akt 的激活，增強了HeLa 細胞的放射敏感性。蘿卜硫素聯合放射可能有助于增強蘿卜硫素的抗腫瘤作用，提示蘿卜硫素可能是一種有效的放射增敏劑。