低氧誘導因子1α 調控蛋白酶激活受體1 在低氧誘導心肌細胞凋亡中的作用及機制*

孟慶雯，王曉茜，朱厚玲，張園園△

（1. 海南醫學院第一附屬醫院心血管內科，海南 ?？?570100； 2. 海南醫學院第一附屬醫院老年病科，海南 ?？?570100）

低氧或缺氧在許多生物學或病理學過程中有至關重要的作用，特別是與缺氧與心肌缺血疾病相關，初期會引起細胞保護性反應，但最終會導致心肌細胞凋亡，嚴重影響其心臟功能［1］。細胞暴露于低氧濃度下會引發低氧反應，其生長和生存能力降低，主要由低氧誘導因子1 （HIF-1）協調［2］。低氧誘 導因子由3 種α 亞基（HIF-1α，HIF-2α，HIF-3α）和1 個β 亞基［（HIF-1β，又稱芳基碳氫化合物核轉運蛋白（ARNT）］構成的異質二聚體［3］。缺氧條件下，HIF-1α 與靶基因結構上的低氧反應元件（HRE 5′-RCGTG-3′）結合，被活化的HIF-1α 在靶基因轉錄起始部位形成一個轉錄起始復合物，從而調節靶基因的轉錄［4］。近年來，有研究表明，HIF-1α 在低氧條件下有誘導細胞凋亡的功能［5］。如何減少心肌細胞凋亡已成為保護心肌細胞的一大研究熱點，盡管已被證實HIF-1α 在低氧條件下心肌細胞中表達被上調［5-6］，但尚未報道HIF-1α 與PAR1 在低氧條件下心肌細胞中的相互作用。

蛋白酶激活受體（PARs）是單個7 跨膜G 蛋白偶聯受體的一個亞家族，包括PAR1，PAR2，PAR3，PAR4［7］。其中PAR1 已被報道在多種細胞中有改變細胞形態和抑制細胞凋亡的作用，如胃癌細胞［8］、乳腺癌細胞［9］、結腸癌細胞［10］、食道癌細胞［11］、臍靜脈內皮細胞［12］、肺動脈內皮細胞［13］等。有文獻報道，PAR1 和HIF-1α 的表達強度在化學治療（簡稱化療）前后的乳腺癌組織中呈正相關［14］。本研究中探討了低氧條件下HIF-1α 和PAR1 在H9c2 細胞中的表達，HIF-1α 和PAR1 的潛在關系，以及在低氧誘導心肌細胞凋亡中的作用和機制，為心肌缺血的預防及治療提供了可能的靶點。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與細胞

儀器：細胞培養箱；低溫冰箱，均購自美國Thermo Fisher 公司；垂直電泳系統，蛋白轉移系統，ChemiDocTMXRS+型凝膠成像分析系統，均購自美國BIO-RAD 公司；普通PCR 儀96 well，熒光實時定量PCR 儀，均購自美國Applied Biosystems 公司；倒置熒光顯微鏡，普通光學顯微鏡，均購自日本Olympus；M200 PRO 型酶標儀購自奧地利Tecan Infinite 公司。

試劑：DMEM 培養基（批號為12800017），胎牛血清（批號為16000-044），均購自美國Gibco 公司；引物由上海生物工程有限責任公司合成；質粒小抽試劑盒（批號為D0003），BCA 試劑盒（批號為P0011），均購自Beyotime 公司；LipofectamineTM3000（美國Invitrogen 公司，批 號 為L3000-015）；Trizol 試 劑，RIPA 裂 解 液，IP Buffer 裂解液，均購自Themo Fisher Scientific 公司；SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒（日本TaKaRa 公司，批號為RR420A）；四氮唑（MTT，Solarbao，批號為M8180）；原位末端轉移酶標記（TUNEL）試劑盒（上海Roche 公司，批號為11684817910）；兔抗HIF-1α 抗體（批號為36169），兔抗Bcl-2 抗體（批號為3498），兔抗Bax 抗體（批號為5023），兔抗β-actin 抗體（批號為8457），均購自美國Cell Signaling Technology 公司；兔抗PAR1 抗體（美國Abcam 公司，批號為ab32611）。

細胞：大鼠心肌細胞系H9c2（中國科學院上海細胞生物學研究所）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養H9c2 細胞，置37 ℃、95%O2、5%CO2細胞培養箱中培養，48 h 全換液1 次，保證細胞正常生長所需營養，待細胞密度長至90%，使用0.25%胰酶消化進行傳代。選取對數生長期的細胞進行試驗，將細胞分為常氧組和低氧組。常氧組將細胞置37 ℃、95%O2、5%CO2培養箱中培養，低氧組將細胞置37 ℃、1%O2、94%N2、5% CO2培養箱中培養。

1.2.2 質粒構建

選擇PSUPER 作為載體，對公司合成的引物進行1 000 r/min、4 ℃離心5 ～10 min，按管壁上標注的體積加入Milli-Q 水，混勻，4 ℃保存待用，或直接進行PCR，擴增出目的片段，制備1%瓊脂糖凝膠，將目的片段點樣并跑膠，跑膠結束后在紫外燈下進行切膠，采用DNA 純化回收試劑盒進行膠回收，對膠回收產物進行跑膠驗證，再進行酶切、酶聯、轉化、質粒抽提，初步得到HIF-1α siRNA 和PAR1 siRNA 質粒，再對質粒進行酶切驗證，對PCR 產物進行瓊脂糖凝膠，驗證質粒是否構建成功。

1.2.3 細胞轉染

轉染前，對細胞進行全換液，待細胞密度長至60%時進行轉染。轉染時取3 個滅菌的EP 管，分別加入500μL無血清的DMEM，再加入質粒和LipofectamineTM3000，混勻，室溫靜置5 min，將含有LipofectamineTM3000 的無血清DMEM 均分于已加質粒的EP 管中，混勻，室溫靜置20 min，將EP 管中的混合液加入H9c2 心肌細胞培養皿，在37 ℃、95%O2、5%CO2培養箱中培養6 h，更換新的培養液繼續培養，24 h 后再對細胞進行低氧（37 ℃、1%O2、94%N2、5%CO2）處理。

1.2.4 蛋白質印跡（WB）法檢測HIF-1α 和PAR1 的蛋白表達

待各處理組細胞長至對數生長期，用IP Buffer 裂解液（含0.5%NP40 并加入蛋白酶抑制劑）在4 ℃搖床裂解細胞30 min，14 000 r/min，（4 ℃）離心15 min，取上清液，按Bradford 法進行蛋白質定量，加入4sample Buffer 混合，沸水浴10 min，制備8%的SDS-PAGE 膠進行點樣電泳（分離膠80 V、20 min，濃縮膠100 V，1 h），轉膜（100 V、150 min），用5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，用1 TBST 洗3 次，每次10 min，一抗包括兔抗β-actin抗體（1 ∶2 000），兔抗HIF-1α 抗體（1 ∶2 000），兔抗PAR1 抗體（1 ∶2 000），兔抗Bcl-2 抗體（1 ∶2 000），兔抗Bax 抗體（1 ∶2 000），于4 ℃搖床孵育過夜，次日用1 TBST 洗3 次，每次10 min，室溫孵育二抗山羊抗兔IgG 抗體（1 ∶1 000）1 h，再用1 TBST 洗3 次，每次10 min，顯影曝光。用Image-Pro Plus 圖像分析系統對蛋白條帶進行分析。

1.2.5 RNA 提取和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測HIF-1α 和PAR1 的mRNA 表達

采用TRIzol 提取細胞總RNA。用Nanodrop 2000 型超微量分光光度計測量樣品總RNA 濃度，并將每個配對的樣品調節至相同濃度。采用cDNA 逆轉錄試劑盒將總RNA 反轉錄成cDNA。使用SYBR Premix EX TaqTM試劑盒進行RT-PCR。GAPDH 作為HIF-1α，PAR1，Bcl-2，Bax 的內部參考。使用FTC-3000p 型實時PCR 系統完成實驗后，采用2-△△Ct法分析數據。引物見表1。

表1 引物序列

1.2.6 RNA 印跡（NB）法檢測HIF-1α 和PAR1 的RNA 水平

制備1%的瓊脂糖凝膠，將提取的總RNA 進行點樣并電泳（120 V、20 min），分離得到的RNA 膠進行轉膜，轉移到硝酸纖維素膜上，進行15 h 轉膜，結束后，將膜放在6×SSC 中浸泡5 min，以去除膜上殘留凝膠。將凝膠置紫外燈下，觀察膠塊上有無殘留的RNA，膜置80 ℃，真空干烤1 ～2 h?？靖珊蟮哪び盟芰洗芊猓? ℃保存備用，進行探針標記和雜交，42 ℃雜交16 h 后，洗膜，顯影。

1.2.7 TUNEL 法檢測心肌細胞凋亡

分別取出常氧組、低氧組、NC 組和PAR1 組的H9c2 心肌細胞爬片，用預冷的4%多聚甲醛（PFA）在4 ℃冰箱中固定30 min，用1×PBS（pH=7.4）洗10 min，加入含有0.2% Triton-X-100 的磷酸緩沖液（PBS），冰上孵育2 min，增加細胞通透性，再加入熒光素FITC 標記的核苷酸和脫氧核苷酸末端轉移酶（TDT）混合液，37 ℃避光孵育60 min，1×PBS（pH=7.4）洗3 次，每次10 min，用抗熒光淬滅封片劑封片，待封片劑干透后將載玻片置4 ℃冰箱保存，次日在熒光顯微鏡下觀察。

細胞凋亡指數=凋亡細胞核百分比/細胞核總數

1.2.8 MTT 法檢測細胞活力

待H9c2 心肌細胞長至對數生長期，用0.25%胰酶消化細胞，收集于離心管，以1 000 r/min 離心5 min，用新的培養液重懸細胞，接種至96 孔板，接種密度為1×105，每孔100 μL，待細胞貼壁培養6 h 后進行后續實驗處理，每組做6 個復孔，待處理結束后，每孔加入10 μL MTT 溶液（5 mg / mL），培養4 h，吸走培養液，每孔再加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），放置搖床振蕩10 min，使結晶充分溶解，采用酶聯免疫檢測儀上光密度（OD）于490 nm 波長處檢測每孔的吸光度，吸光度最好在0 ～0.7 范圍內。

細胞存活率（%）=（OD試驗組/OD對照組）×100%

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0 統計學軟件分析。至少取3 次獨立實驗結果，以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用LSD 法，多組間比較采用單向方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 低氧條件下對H9c2 細胞活力及凋亡的影響

對H9c2 細胞進行常氧和低氧時間梯度（2，6，12，24 h）處理，通過形態觀察發現，與常氧組相比，低氧各組細胞形態縮小、變形，詳見圖1 A；TUNEL 染色結果顯示，與常氧組相比，低氧各組H9c2 細胞凋亡隨時間梯度逐漸增加，詳見圖1 B 和圖1 C；MTT 分析結果顯示，與常氧組相比，低氧各組H9c2 細胞的活力更差，詳見圖1 D?？梢姡脱踅档土薍9c2 細胞的活力，并誘導了H9c2 細胞的凋亡。

2.2 HIF-1α 和PAR1 在低氧條件下H9c2 細胞中的表達情況

qRT-PCR 結果顯示，低氧條件下H9c2 細胞中HIF-1α 和PAR1 的表達上調，隨著低氧時間梯度處理有上升趨勢，詳見圖2 A。WB 結果與qRT-PCR 檢測結果一致，詳見圖2 B 及圖2 C?？梢?，低氧誘導HIF-1α和PAR1 的表達。

2.3 敲除PAR1 對低氧條件下H9c2 細胞活力及細胞凋亡的影響

構建PAR1 siRNA 質粒，將PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，初步驗證質粒構建成功，詳見圖3 A。將構建好的質粒進行細胞轉染，將H9c2 細胞分為4 組，分別為常氧組（A 組）、常氧+siNC 組（B 組）、低氧+siNC 組（C 組）和低氧+PAR1 siRNA 組（D 組）。WB 結果顯示，與C 組比較，D 組的PRA1 顯著降低，表明細胞轉染成功，詳見圖3 B 和圖3 C。通過形態觀察發現，在H9c2 細胞中敲除PAR1 后再低氧處理H9c2 細胞，相比于直接低氧處理H9c2 細胞，H9c2 細胞體積明顯增大，詳見圖3 D。TUNEL 染色結果顯示，在H9c2 細胞中敲除PAR1 后再低氧處理H9c2 細胞比直接低氧處理H9c2 細胞可明顯緩解由低氧引起的H9c2 細胞凋亡，詳見圖3 E 和圖3 F。MTT 結果顯示，在H9c2 細胞中敲除PAR1 后再低氧處理H9c2 細胞，比直接低氧處理H9c2 細胞可明顯提高H9c2 細胞的活力，詳見圖3 G?？梢?，在H9c2 細胞中敲除PAR1 可改善由低氧引起的H9c2 細胞體積的縮小，增強H9c2 細胞活力，并抑制H9c2 細胞的凋亡。

圖1 低氧條件下H9c2 細胞活力及生存變化情況

圖2 低氧條件下H9c2 細胞中HIF-1α 和PAR1 的表達情況

2.4 敲除PAR1 對低氧條件下H9c2 細胞中HIF-1α及Bcl-2/Bax 表達的影響

低氧條件下會誘導H9c2 細胞凋亡，而Bcl-2/Bax信號通道已被報道可抑制細胞凋亡。為探討低氧條件下PAR1 表達對H9c2 細胞的作用機制，將siNC 和PAR1 siRNA 質粒轉染至H9c2 細胞24 h 后，對細胞進行低氧處理6 h。通過WB 法和qRT-PCR 法檢測Bcl-2 和Bax 的表達。WB 結果顯示，Bcl-2 在低氧時表達下降，敲除PAR1 后再低氧處理H9c2 細胞，相比于低氧時增加了Bcl-2 的表達。而Bax 在低氧時表達增加，敲除PAR1 后再低氧處理H9c2 細胞，相比于低氧時又降低了Bax 的表達，詳見圖4 A。qRT-PCR 結果與WB 結果一致，與常氧組相比，低氧組Bcl-2 表達下降，Bax 表達下降上升；與C 組相比，D 組Bcl-2 表達被上調，詳見圖4 B。Bax 表達下降被下調，詳見圖4 C。結果表明，在低氧條件下，H9c2 細胞中敲除PAR1 可通過調控Bcl-2/Bax 的表達比例來抑制細胞的凋亡。

圖3 敲除PAR1 對低氧條件下H9c2 細胞形態、細胞凋亡及活力的影響

2.5 抑制HIF-1α 的表達對低氧條件下引起的PAR1 上調的影響

將siNC 和HIF-1α siRNA 轉染至H9c2 細胞中24 h后再低氧處理細胞6h，通過NB 法和WB 法檢測HIF-1α和PAR1 在H9c2 心肌細胞中的表達。結果見圖5 A 和圖5 B，與C 組相比，低氧+HIF-1α siRNA 組（E 組）明顯限制了由缺氧引起的PAR1 的上調，表明低氧條件下PAR1 的表達受HIF-1α 的正調控。

圖4 敲除PAR1 對HIF-1α，Bcl-2 /Bax 表達的影響

圖5 敲除HIF-1α 限制缺氧引起的PAR1 的上調

3 討論

缺氧常被用來解釋心臟功能的改變，特別是在心肌缺血的患者中，缺氧是一種常見現象［15］。多數研究表明，缺氧導致心肌缺血的致病機制非常復雜，如在輕度或中度缺氧時，大腦的能量供應幾乎未受到損害，嚴重缺氧時會產生細胞毒性，引起細胞凋亡或死亡［16］。細胞凋亡主要是由于外源性死亡受體途徑或線粒體途徑介導發生［17］。因此，深入了解細胞凋亡在缺氧條件下的調控機制，可為心肌缺血的治療提供更具體的方法。

HIF-1α 是缺氧條件下參與血管生成、糖酵解代謝和細胞增殖/存活過程中調控多個基因轉錄的關鍵蛋白［18］，是一種氧依賴性被細胞內泛素蛋白酶降解的蛋白質［19］。其只在缺氧條件下穩定表達，HIF-1α 積累和HIF-1β形成二聚體，二聚體激活啟動子區中含有缺氧反應元件（HREs）的下游基因［20］。HIF-1α 在常氧時不表達，在低氧條件下高表達，且HIF-1α 表達的上調可促進細胞的凋亡［21-22］。本研究結果顯示，HIF-1α 在低氧條件下H9c2 細胞中高表達，且可誘導H9c2 細胞的凋亡，與文獻［23］報道一致。進一步在低氧條件下H9c2 細胞中轉染HIF-1α siRNA，WB 和NB 檢測結果顯示，HIF-1α可正調控PAR1 的表達，表明PAR1 可能是HIF-1α 的下游。

PAR1 是一種G 蛋白偶聯的跨膜受體，為高親和力凝血酶受體［7，24］，幾乎在所有類型的血管壁細胞中表達，包括內皮細胞、平滑肌細胞、血小板和巨噬細胞，并參與了內皮細胞的凋亡［25］。本研究中通過WB 和RT -PCR 法檢測了PAR1 在低氧條件下H9c2 細胞中的蛋白和mRNA 表達水平，結果顯示，PAR1 在低氧條件下高表達。同時，當在H9c2 細胞中敲除PAR1后再低氧處理細胞，發現敲除PAR1 可促進H9c2 細胞活力和抑制細胞凋亡，并上調Bcl -2 的表達和下調Bax 的表達。Bcl -2 基因家族是通過調節細胞的生存或死亡來維持組織的發育及穩態的，是一種新的原癌基因，即細胞凋亡的調節因子［26］，其他主要通過抑制各種凋亡小體來延長細胞的存活［27］。Bax 是一種加速細胞死亡的同源蛋白，與Bcl -2 活性相反［28］。但Bcl -2 與Bax 可相互作用，在體內形成異二聚體，Bax過表達會抑制Bcl -2 的活性，引起細胞凋亡，兩者表達的比例發生變化會直接影響細胞的生存與凋亡［29］，故Bcl -2 / Bax 信號通路是調節抗氧途徑細胞凋亡的變阻器［30］。本研究結果顯示，H9c2 細胞中敲除PAR1可影響Bcl -2 與Bax 表達的比例，進而誘導H9c2 細胞的凋亡。

綜上所述，低氧條件下，HIF-1α 通過正調控PAR1的表達，進而改變Bcl-2/Bax 的表達比例，誘導H9c2細胞凋亡。本研究結果為低氧條件下細胞凋亡引起的心肌缺血提供了可能的治療靶點。