胃饑餓素對HK-2 細胞缺氧/復氧損傷后的保護作用及機制*

王莉芳，馮正平，李曉春，張金山

（1. 陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710062； 2. 西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室·藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室·陜西師范大學生命科學學院，陜西 西安 710062； 3. 空軍軍醫大學解剖與組織胚胎學教研室，陜西 西安 710062）

胃饑餓素（ghrelin）是從胃中分離發現的，由28 個N 端第3 位絲氨酸殘基N 辛酰化修飾的氨基酸組成的多肽［1］，是內源性生長激素促分泌素受體（GHSR）［2］，具有廣泛的組織分布，通過GHSR 發揮多種生物學作用，在腎臟中也有分布。有研究表明，外源性注射胃饑餓素對急性腎損傷有預防作用［3-4］。急性腎損傷易出現在腎缺血再灌注，稱為腎缺血再灌注損傷（IRI）。腎臟的損傷從缺血開始，恢復灌注后組織會進一步處理損傷，包括中性粒細胞的聚集，游離自由基的產生和細胞因子的激活等［5］。IRI 過程中缺氧會導致不正常的信號傳導，引起一系列病理改變，導致腎功能嚴重受損［6-7］。本研究中采用HK-2 細胞建立缺氧/復氧損傷模型，在體外模擬腎缺血再灌注損傷過程，觀察胃饑餓素對IRI 的影響及其作用機制，通過CCK-8、原位末端轉移酶標記（TUNEL）法、蛋白質印跡（WB）法觀察在胃饑餓素作用下HK-2 細胞的活力、凋亡情況及相關信號通路蛋白表達情況，為進一步在預防腎損傷領域應用胃饑餓素提供依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：3131 型三氣培養箱（美國Thermo 公司）；MCO-18AIC 型二氧化碳培養箱（日本SANYO 公司）；1300 SERIES A2 型生物安全柜（美國Thermo 公司）；Do X6 型全自動化學發光圖像分析系統（上海天能公司）。

試藥：胃饑餓素（美國Sigma-Aldrich 公司，批號為G3902）；細胞外調節蛋白激酶（ERK）兔一抗（批號為4695T），細胞外調節蛋白激酶磷酸化（p-ERK）兔一抗（批號為4370T），P38 促分列素原活化蛋白激酶（P38）兔一抗（批號為8690T），磷酸化P38 促分列素原活化蛋白激酶p-P38 兔一抗（批號為4511T），均購自美國CST 公司；TUNEL 試劑盒（瑞士ROCH 公司，批號為11684817910）；β-actin 兔一抗（批號為ab8227），HRP標記抗兔二抗（批號為ab6721），均購自Abcam 公司；其他試劑均為國產分析純。

細胞：HK-2 細胞購自中科院細胞所。

1.2 細胞培養

將HK-2 細胞株加入DMEM/F12 培養液（含10%胎牛血清）中進行培養，再將其置孵育箱內（37 ℃，5%CO2），孵育箱需維持飽和濕度等適宜的培養條件，在無菌條件下開始進行傳代培養。當細胞鋪滿玻片壁后，用0.25%濃度的胰酶傳代，同步化24 h 后細胞進入指數生長期，細胞每3 ～5 d 可傳代1 次。

1.3 建立細胞缺氧/復氧損傷模型

采用體外細胞培養，缺氧/復氧模型模擬缺血再灌注模型。將正常培養的HK-2 細胞置0.25%濃度的胰酶消化，計數后按2×104個/孔接種于96 孔板中。于第2 天將96 孔板置三氣培養箱內（37 ℃，5%CO2，1%O2），分別培養0，1，2，3，4 h，移至正常培養箱內（37 ℃，5%CO2）12 h。

1.4 CCK-8 法檢測細胞活力

將質量濃度為0，12.5，25，50，100，200，400，800，1 600 ng / mL 的胃饑餓素加入2 ×104個/ 孔的96 孔板中，每組平行4 個。于正常培養箱內（37 ℃，5%CO2）孵育2 h，置三氣培養箱中（37 ℃，5%CO2，1%O2）培養4 h，于正常培養箱內（37 ℃，5% CO2）孵育12 h。每孔加入新鮮配制的含10 μL 的毒性檢測液CCK-8，將培養板在培養箱孵育3 h，用酶標儀測定450 nm 波長處的吸光度（A）值。

1.5 試驗分組

將正常培養的HK-2 細胞置0.25%濃度的胰酶消化，計數后按1 ×105個/ 孔接種于預先放置爬片的24 孔板中。第2 天將細胞分為3 組，正常組（N 組）細胞正常培養16 h；缺氧/復氧損傷組（H/R 組）不做處理的細胞于正常培養箱內（37 ℃，5%CO2）孵育2 h，將孔板置三氣培養箱內（37 ℃，5%CO2，1%O2）培養4 h，然后移至正常培養箱內（37 ℃，5%CO2）12 h；胃饑餓素預處理組+缺氧/復氧損傷組（ghrelin+H/R 組）將質量濃度為400 ng/mL 的胃饑餓素加入24 孔板中，正常培養箱內（37 ℃，5%CO2）孵育2 h，置三氣培養箱內（37 ℃，5%CO2，1%O2）培養4 h，移至正常培養箱內（37 ℃，5%CO2）12 h。

1.6 TUNEL 法檢測細胞凋亡

各組細胞培養時加入細胞爬片，按1.5 項下方法培養。將各組爬片置4%多聚甲醛固定，以Streptavidin 工作液覆蓋孵育樣品，DAPI 復染封片。200倍顯微鏡下觀察，細胞核呈黃色為陽性的凋亡細胞。

1.7 WB 法檢測蛋白表達

用RIPA 裂解液提取各組細胞總蛋白，30 μg 的蛋白樣品在10%SDS-PAGE 凝膠上分離，并轉移到PVDF 膜上；PVDF 膜用5%脫脂牛奶封閉2 h；PVDF 膜在4 ℃溫度下與一抗孵育過夜，再用1 ∶2 000 辣根過氧化物酶結合的二級抗體室溫下孵育1 h；蛋白條帶以化學發光法顯色獲得。

1.8 統計學處理

采用Graphpad Prism 5 統計學軟件分析。試驗數據經單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用Tukey′s Multiple Comparisons Test。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞缺氧/復氧損傷模型的建立

HK-2 細胞置三氣培養箱（37 ℃，5%CO2，1%O2）缺氧1，2，3 h 后，正常培養箱（37 ℃，5%CO2）復氧12 h均不能有效影響細胞活力，缺氧4 h 正常培養箱（37 ℃，5%CO2）復氧12 h，細胞活力顯著降低（P＜0.01）。表明HK-2 細胞置三氣培養箱中（37 ℃，5%CO2，1%O2）缺氧4 h，置正常培養箱（37 ℃，5%CO2）復氧12 h，能有效誘導其缺氧/復氧損傷模型。詳見圖1。

圖1 細胞缺氧/復氧損傷模型的建立

2.2 不同質量濃度對細胞活力的影響

CCK -8 試驗結果表明，采用質量濃度為12.5，25，50 ng/mL 的胃饑餓素預處理2 h 后，對缺氧/復氧損傷的HK-2 細胞無明顯影響。但胃饑餓素質量濃度為100，200，400，800 ng / mL 預處理能有效提高細胞活 力（P＜0.01），且當質量濃度為1 600 ng/mL 時，HK-2 細胞的活力開始降低，表明胃饑餓素質量濃度為1 600 ng/mL 時不利于HK-2 細胞的生存。詳見圖2。

圖2 不同質量濃度胃饑餓素對缺氧/復氧損傷HK-2 細胞的影響

為進一步驗證胃饑餓素對正常HK-2 細胞的影響，將不同質量濃度的胃饑餓素加入正常HK-2 細胞中，且置正常培養箱（37 ℃，5%CO2）孵育16 h。每孔加入新鮮配制的含10 μL 的毒性檢測液CCK-8，將培養板在培養箱孵育3 h，用酶標儀測定450 nm 波長處的吸光度，結果見圖3。可見，質量濃度為12.5，25，50，100，200，400 ng/mL 的胃饑餓素均不影響HK-2 細胞的生長，但胃饑餓素質量濃度為800，1 600 ng/mL 時，HK-2細胞的活力顯著降低（P＜0.05）。表明胃饑餓素質量濃度大于800 ng/mL 不利于HK-2 細胞的生存。

圖3 不同質量濃度胃饑餓素對正常HK-2 細胞的影響

2.3 對缺氧/復氧損傷的HK-2 細胞凋亡的影響

TUNEL 試驗結果顯示，N 組HK-2 細胞未明顯凋亡，但H/R 組中HK-2 細胞出現大量凋亡，但胃饑餓素（400 ng/mL）預處理后，HK-2 細胞凋亡明顯減少。表明胃饑餓素能有效抑制由缺氧/復氧損傷誘導的HK-2 細胞的凋亡，詳見圖4。

圖4 胃饑餓素對缺氧/復氧損傷的HK-2 細胞凋亡的影響

2.4 對細胞中ERK 表達的影響

WB 試驗結果表明，胃饑餓素對缺氧/復氧損傷的HK-2 細胞中總ERK 蛋白及磷酸化p-ERK 蛋白表達無影響，β-actin 為內參蛋白。詳見圖5。

圖5 胃饑餓素對缺氧/復氧損傷的HK-2 細胞中ERK 表達的影響

2.5 對細胞中P38 表達的影響

WB 試驗結果表明，胃饑餓素預處理后能顯著增加缺氧/復氧損傷的HK-2 細胞中磷酸化P38 蛋白的表達。表明胃饑餓素可能是通過激活P38 信號通路保護HK-2 細胞缺氧/復氧的損傷。詳見圖6。

3 討論

腎缺血再灌注的發病機制包括氧自由基的毒性、細胞凋亡、炎性反應、細胞內鈣超載等，針對這些致病機制采取對應的治療措施［8］。

圖6 胃饑餓素對缺氧/復氧損傷的HK-2 細胞中P38 表達的影響

ANDREWS 等［9］研究發現，胃饑餓素可通過減少線粒體中活性氧來發揮抗氧化作用［9］；胃饑餓素被證明可增加神經元細胞中UCP2 蛋白的表達［10］；外源性注射胃饑餓素能刺激催乳素、促腎上腺皮質激素（ACTH）、皮質醇的分泌；胃饑餓素能通過引起嚙齒動物和人類高血糖，降低胰島素水平發揮厭食效應；胃饑餓素在心力衰竭和心肌缺血再灌注損傷中可起保護作用，在其他疾病如膿毒癥和腸道缺血再灌注損傷中有有益作用［11］。

KEIKO 等［12］的研究發現，胃饑餓素在小鼠中能通過抗氧化應激機制保護其免受促血管生成素Ⅱ引起的腎臟損害。胃饑餓素通過迷走神經對動物腎缺血再灌注起保護作用［13］。提示胃饑餓素能在腎缺血再灌注損傷中起到一定作用，但其如何在這個過程發揮作用的機制尚不明確。

本研究中以人腎皮質近曲小管上皮細胞HK-2 細胞為模型，成功建立了體外缺氧/復氧損傷模型，并模擬腎缺血再灌注損傷模型。研究結果顯示，胃饑餓素能提高缺氧/復氧細胞的活力，高質量濃度的胃饑餓素對細胞活力有一定損傷，提示在使用胃饑餓素預防腎缺血再灌注損傷時應當注意選擇適當的濃度進行預處理，能在缺氧/復氧細胞模型中起到保護作用。WB 檢測結果顯示，ERK 蛋白表達無變化，胃饑餓素預處理后，p-P38 蛋白含量有顯著提升。P38 有絲分裂素激活蛋白激酶（MAPK）是與細胞增殖、分化、凋亡密切相關的細胞轉導的重要通道［14］。代謝綜合征大鼠血管周圍脂肪組織來源的瘦素可通過P38 通路促進血管平滑肌細胞由收縮型轉換為增殖型［15］。故推測胃饑餓素能通過激活P38 信號通路保護HK-2 細胞缺氧/復氧的損傷，為進一步探討胃饑餓素如何在腎缺血再灌注損傷中發揮作用提供了新思路。