雷帕霉素聯合肝動脈化療栓塞術對兔肝移植瘤模型中相關因子表達的影響△

張君娜，蔡靜，宋華勇，吳濤

河南大學第一附屬醫院1病理科，2腫瘤內科，3影像科，河南 開封 475001

肝癌是常見的消化系統惡性腫瘤。數據顯示，2015年，全球因肝癌死亡病例達81.0萬人，僅次于肺癌[1]。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）是一種從吸水鏈霉菌發酵液中分離的抗真菌抗生素[2]。近年來，研究證實RAPA在肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌及婦科腫瘤等多種腫瘤中具有較強的抑制腫瘤生長、誘導細胞凋亡的作用[3]。另外，RAPA具有不良反應少的特點，可在不損傷正常組織細胞的情況下，阻斷雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號通路，抑制腫瘤細胞的增殖[4]。目前，僅在移植手術后的免疫抑制等方面展開了RAPA相關臨床試驗，而RAPA對惡性腫瘤抑制作用的具體機制尚不完全清楚[5]。本文擬通過建立肝移植瘤兔模型，研究RAPA通過經導管肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）給藥時，肝癌組織中缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、血管內皮生 長因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）3種腫瘤生長相關因子的表達情況，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選擇購自河南省疾病預防控制中心的健康新西蘭大白兔，共21只，雌雄不限，體重（2.7±0.3）kg，實驗動物許可證號：SYXK（豫）2017-0009。兔VX2腫瘤細胞購自通派（上海）生物科技有限公司。雷帕霉素由杭州中美華東制藥有限公司生產，表柔比星由山東新時代藥業有限公司生產，絲裂霉素由海正輝瑞制藥有限公司生產。HIF-1α、VEGF和MMP2免疫組化試劑盒均購自上海雅吉生物科技有限公司。實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）所需試劑和引物均購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立兔肝移植模型 恒溫37℃水浴解凍冰凍的VX2腫瘤組織，取魚肉樣解凍組織于由青霉素和生理鹽水配制的溶液（160萬U/dl）中，剪碎成約2 mm大小，用粗針穿刺注射入一只健康大白兔后腿肌肉深部。兩周后，取出新鮮VX2腫瘤組織剪碎成約2 mm大小，開始建模。水合氯醛麻醉后，實驗兔仰臥位固定，利多卡因局部浸潤，于劍突下切開約2 cm，暴露肝左葉，粗針穿刺置入2～3顆VX2腫瘤組織，使用明膠海綿止血。術后抗感染3 d。2周后行計算機斷層掃描（CT）檢查，20只實驗兔全部建模成功，肝臟內存在腫瘤。

1.2.2 分組及治療方案 采用隨機數字表法將20只建模成功的實驗兔隨機均分為研究組和對照組。對照組給予表柔比星1 mg/kg+絲裂霉素0.2 mg/kg；研究組在對照組基礎上給予RAPA 1 mg/kg。所有實驗兔均以碘化油溶解藥物制成乳劑，經TACE途徑給藥。TACE的具體操作方法：實驗兔常規麻醉（氯胺酮22 mg/kg）后固定于操作臺，穿刺股動脈，置入微導管，進行肝總動脈造影，明確肝移植瘤大小、位置及滋養血管位置。再配合微導絲，將微導管置于腫瘤滋養血管，然后灌注化療栓塞藥物，當腫瘤滋養血管完全栓塞、腫瘤內造影劑濃集則停止注射。退出導管，壓迫穿刺點止血。

1.2.3 CT 測量腫瘤體積 分別于治療當天、治療后3天及治療后7天，對模型兔肝腫瘤進行CT平掃，測量最大截面的長徑和短徑，計算腫瘤體積。

1.2.4 免疫組化染色法檢測蛋白表達 第3次CT掃描后處死實驗兔，解剖肝臟，嚴格按照免疫組化試劑盒操作，檢測肝癌組織中HIF-1α、VEGF和MMP2蛋白的表達水平，當肝細胞內出現棕黃顆粒即為陽性。采用圖像分析軟件分析相應的光密度（optical density，OD）值，選擇圖像中的陽性區域，得出這些區域的平均OD值。每只實驗兔取3份標本，每個切片隨機選擇5個視野進行測量，取平均值。

1.2.5 RT-qPCR法檢測mRNA表達 取兔移植瘤組織100 mg充分剪碎研磨，然后加入1 ml Trizol勻漿，提取總RNA，然后經逆轉錄生成cDNA，置于-20℃冷凍備用。嚴格按照聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增操作流程繪制工作曲線、擴增目的基因。3種待測的mRNA（HIF-1α、VEGF和MMP2mRNA）均以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA 作為內參基因，采用 2-ΔΔCt值表示目的mRNA的相對表達量。引物序列：GAPDH的上游引物為5'-CACCCACTCCTCTA CCTTCG-3'，下游引物為5'-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3'；HIF-1α的上游引物為5'-CATGTTCCCTTCATCCAATG-3'，下游引物為5'-TGCAGGGTCAGCACTACTTC-3'；VEGF的上游引物為5'-AGGAGACAATAAAC CCCACG-3'，下游引物為 5'-CACACTCCAGGCTTTCATCAT-3'；MMP2的上游引物為 5'-ATGACATCAAGGGCATTCAA-3'，下游引物為5'-ACGATGTCCTGTGTGCAGAT-3'。

1.3 觀察指標

觀察給藥后兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積，檢測并比較兩組肝癌實驗兔移植瘤組織中HIF-1α、VEGF、MMP2蛋白及相應mRNA的相對表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，連續測量數據的比較采用重復測量方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組肝癌實驗兔腫瘤體積的比較

治療后，兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積組間比較，差異有統計學意義（F組間=3.461，P組間＜0.01）；兩組肝癌實驗兔不同時間點（治療當天、治療后3天、治療后7天）的腫瘤體積比較，差異均有統計學意義，且腫瘤體積均隨著時間的延長而逐漸增大（F時間=107.335，P時間＜0.01）；兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積在時間和組間上存在交互作用，差異均有統計學意義（F交互=35.103，P交互＜0.01）。（表1）

表1 兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積變化（cm3，±s）

表1 兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積變化（cm3，±s）

組別對照組（n=1 0）研究組（n=1 0）4.6 5±0.7 5 4.6 9±0.6 3 7.4 0±0.5 2 6.4 0±0.3 9 9.6 5±0.8 8 7.9 0±0.4 6治療當天治療后3天治療后7天

2.2 HIF-1α、VEGF和MMP2蛋白及mRNA相對表達量的比較

免疫組化染色結果顯示，研究組兔肝移植瘤模型肝癌組織中HIF-1α、VEGF和MMP2蛋白的相對表達量均明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）（表2）。RT-qPCR結果顯示，研究組兔肝移植瘤模型肝癌組織中HIF-1α、VEGF和MMP2的mRNA的相對表達量均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表3）。

表2 兩組兔肝移植瘤模型肝癌組織中HIF-1α、VEGF和MMP2蛋白相對表達量的比較（±s）

表2 兩組兔肝移植瘤模型肝癌組織中HIF-1α、VEGF和MMP2蛋白相對表達量的比較（±s）

組別對照組（n=1 0）研究組（n=1 0）t值P值1.9 8±0.0 9 1.7 3±0.0 9 6.2 1 1＜0.0 1 1.8 2±0.1 0 1.5 7±0.0 9 5.8 7 6＜0.0 1 2.0 6±0.1 1 1.7 3±0.0 9 7.3 4 2＜0.0 1 H I F-1 α V E G F M M P 2

表3 兩組兔肝移植瘤模型肝癌組織中H-IF-1α、VEGF和MMP2 mRNA相對表達量的比較（±s）

表3 兩組兔肝移植瘤模型肝癌組織中H-IF-1α、VEGF和MMP2 mRNA相對表達量的比較（±s）

組別對照組（n=1 0）研究組（n=1 0）t值P值1.2 5±0.0 9 1.1 4±0.1 2 2.3 1 9＜0.0 5 1.1 8±0.0 8 1.0 9±0.0 7 2.6 7 7＜0.0 5 1.2 2±0.1 1 1.0 6±0.0 8 3.7 2 0＜0.0 5 H I F-1 α m R N A V E G F m R N A M M P 2 m R N A

3 討論

2015年，中國肝癌新發病例數占全球肝癌新發病例總數的54.58%（46.61萬/85.40萬），但是，被明確診斷時，多數患者已錯過直接手術的機會，造成嚴重的社會健康負擔[1,6]。對于中晚期肝癌，介入治療成為了越來越重要的手段，臨床對介入方法和藥物的探索從未停止[7]。有研究發現，RAPA不僅具有免疫抑制作用，還對包括肝癌在內的多種腫瘤細胞具有增殖抑制作用，成為研究熱點[8]。然而，國內外對RAPA抑制肝癌細胞增殖的作用機制的研究還相對較少，因此，本研究選取了HIF-1α、VEGF和MMP2三個常見的腫瘤相關因子進行研究。

TACE是肝癌介入治療的經典方法，可以選擇性中斷腫瘤血供，造成腫瘤組織缺血、缺氧，是減小腫瘤體積、提高手術切除率的重要方法，并有利于肝內微小病灶的診斷和治療[9]。但是，缺血僅能暫時控制腫瘤的進展，必須配合化療藥物，殺死腫瘤細胞，才能發揮更好的治療效果。本研究中，治療后，兩組的腫瘤體積均有所增大，Manjulika[10]的研究指出，肝癌組織邊緣與正常組織呈交錯生長，邊緣腫瘤細胞可以通過正常肝臟血竇汲取營養，提示通過TACE不可能完全阻斷肝癌的生長。本研究中，治療后，兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積比較，差異有統計學意義（F=3.461，P＜0.01），且均隨著時間的延長而逐漸增大（F=107.335，P＜0.01）。兩組肝癌實驗兔的腫瘤體積在時間和組間上存在交互作用（F=35.103，P＜0.01），提示研究組的腫瘤增長速率明顯低于對照組，RAPA可以使TACE抑制腫瘤的效果更好。

HIF-1α在正常細胞中會被迅速分解，在腫瘤等缺氧細胞中能較穩定地存在，是多種信號通路的重要物質，能促進缺氧狀態時腫瘤細胞中VEGF表達的上調，而后者可特異性增加血管通透性，改變血管基質，促進內皮細胞遷移、增殖，從而促進腫瘤新生血管的形成[11]。既往研究證實，TACE治療后，兔移植瘤模型中HIF-1α、VEGF蛋白及mRNA的表達水平均明顯下降[12]。這是由于TACE可以阻斷腫瘤血供，抗腫瘤藥物可殺滅大部分活躍的腫瘤細胞，雖然術后腫瘤組織的乏氧情況加劇，但活躍的細胞數量卻明顯減少，從而總體下調了腫瘤生長相關細胞因子的表達[13]。本研究中，研究組肝癌組織中 HIF-1α、VEGF、MMP2蛋白及mRNA的相對表達量均低于對照組，提示RAPA聯合常規化療方案經TACE給藥能更好地抑制腫瘤細胞的增殖活性，這符合TACE治療中晚期肝癌效果的理論基礎[14]。

MMP2是一種蛋白水解酶，其催化位點包含3個纖維連接蛋白Ⅱ型重復序列，可以使變性Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原與彈性蛋白相結合，從而使細胞外基質和基底膜降解，進而為腫瘤的侵襲與轉移創造條件[15]。本研究中，研究組移植瘤組織中MMP2蛋白及mRNA的表達水平均低于對照組（P＜0.05），提示RAPA可能具有抑制腫瘤細胞轉移的作用，與Dai等[16]的研究結果類似。

綜上所述，RAPA聯合常規化療藥物在抑制兔肝移植瘤生長及HIF-1α、VEGF、MMP2因子的表達方面優于僅用常規化療方案。但是，本研究尚存在不足之處，一是未能檢測兩組實驗兔治療前后肝功能的變化情況，無法了解聯合治療是否會增加肝衰竭的發生風險；二是未對治療后移植瘤邊緣的浸潤情況進行形態學分析，無法了解聯合治療是否會增加腫瘤轉移的發生風險。本研究在分子水平變化方面的結果為臨床提高肝癌TACE的治療效率提供了參考，在下一步實驗中爭取彌補不足，取得進展。