胃癌過繼性T 淋巴細胞免疫治療的研究進展

彭黎明，楊林

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院內科，北京 100021

胃癌作為常見的消化道腫瘤之一，患者往往確診時已處于晚期，經過傳統手術、化療、放療，其5年生存率仍不到20%[1]。近年來，腫瘤免疫治療取得突破性進展，主要歸功于免疫檢查點抑制劑和嵌合抗原受體修飾的T細胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）的顯著臨床療效。免疫治療不僅對其他治療耐藥的腫瘤產生療效，而且能使傳統治療認為不可能治愈的播散性腫瘤獲得長期臨床緩解[2]。然而，仍有相當一部分患者對免疫治療無反應，如抗程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）單抗單藥三線治療晚期胃癌的客觀緩解率（objective response rate，ORR）為11%～12%，患者中位總生存期（overall survival，OS）為5.3～5.5個月[3-4]；單藥二線治療晚期胃癌的ORR為16%，患者中位OS為9.1個月，與標準的單藥紫杉醇化療（中位OS為8.3個月）相比，并無明顯優勢[4]。盡管單藥聯合化療一線治療晚期胃癌的ORR為60%，明顯高于單純化療的25%～48%[5-6]，但并未轉化為OS延長（12個月vs8.0～11.2個月）[6-7]。有效的免疫治療依賴于免疫細胞（尤其是T淋巴細胞）摧毀腫瘤細胞的能力。免疫檢查點抑制劑療效微弱的原因可能與這些患者腫瘤組織周圍浸潤的淋巴細胞數量太少或活性太低有關[8]。過繼性細胞免疫治療（adoptive cell therapy，ACT）是將患者自體的免疫細胞如樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、自然殺傷（natural killer，NK）細胞或T細胞進行體外擴增，然后回輸至患者體內，從而發揮殺傷腫瘤細胞的作用。國外最早于1985年就開始應用ACT治療惡性黑色素瘤[9]，直到2017年，兩種CAR-T細胞被批準用于治療兒童和成人B細胞腫瘤，成為腫瘤過繼免疫治療的里程碑事件。目前，常用的過繼性T淋巴細胞免疫療法主要包括回輸細胞因子誘導的殺傷（cytokine induced killer，CIK）細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）、CAR-T及T細胞受體改造的T細胞（T cell receptor engineered T cell，TCR-T）。

1 ACT 細胞種類及在胃癌中的研究進展

1.1 CIK

CIK細胞是將人外周血單個核細胞在體外由多種細胞因子共培育而獲得的一群異質性細胞，其中，CD3+CD56+細胞為主要效應細胞，既具有T淋巴細胞強大的殺瘤活性，又具有NK細胞非主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex class，MHC）限制性殺瘤的特點，因此，其又被稱為NK樣T淋巴細胞[10]。關于CIK細胞的臨床研究已在肝癌、肺癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中開展[11-16]。DC是迄今為止已知的體內功能最強大的專職抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC），能有效刺激T細胞對異型抗原產生免疫應答。將DC與CIK于體外共同培養，既可促進DC的成熟，又可增強CIK細胞的殺瘤活性。共培養后的DC表面標志物CD40、CD80、CD86的表達比單純DC培養時增加了1.2倍，CIK細胞的活性亦明顯提高[17]。DC-CIK細胞能夠在體外快速增殖，且抗瘤譜廣，安全性好，因而得到廣泛應用[18]。一項對比化療聯合DC-CIK與單純化療一線治療晚期胃癌臨床療效的初步研究發現，化療聯合DCCIK治療具有延長患者OS、無進展生存期（prog-ress free survival，PFS）及提高患者ORR的趨勢，且安全性高；與單純化療相比，DC-CIK治療后的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+、CD3+CD56+細胞數目及百分比均明顯升高，差異顯著[19]。一項前瞻性非隨機對照研究發現，4組晚期胃癌患者分別接受替吉奧（S-1）單藥、S-1+順鉑（SP）、DCCIK+S-1、DC-CIK+SP治療，其疾病控制率（disease control rate，DCR）分別為 5.6%、33.3%、47.1%和76.9%，化療聯合DC-CIK組患者的PFS、OS情況均明顯優于單純化療組；DC-CIK治療后，63.3%的患者的外周血ctDNA突變數量及頻率下降[20]，提示細胞毒性藥物攻擊腫瘤細胞后可引起腫瘤微環境發生改變[20]，進而使腫瘤抗原釋放增加從而提供更多新的抗原表位，促進DC對抗原的呈遞，這種相互作用可使腫瘤血管正常化[21]，從而使細胞毒性T細胞能夠進入腫瘤組織。一項Ⅰ期臨床研究采用于體外經派姆單抗（pembrolizumab）處理的DC-CIK治療既往治療失敗的晚期實體瘤，發現其具有明顯的抗腫瘤活性，γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的分泌明顯增加；31例患者中，7例患者達到部分緩解（partial response，PR），其中，6例患者緩解持續超過5個月，DCR為64.5%；20例患者發生治療相關不良事件（adverse event，AE），2例患者發生3/4級AE（包括發熱、寒戰），所有治療相關AE均是可逆和可控的[22]。CIK細胞與靶向藥物及其他治療在胃癌中的聯合應用仍在探索中。

1.2 TIL

TIL是在腫瘤及其周圍組織聚集的一群具有異質性的免疫細胞，包括T細胞、B細胞和NK細胞等。過繼TIL療法是將腫瘤組織周圍具有腫瘤特異性的T細胞從免疫抑制的腫瘤微環境中分離后在體外擴增、加工，使T細胞數量增多、抗腫瘤活性增強，再回輸至患者體內從而發揮特異性抗腫瘤作用。目前的研究方向是提高回輸效應細胞的質量以及簡化獲得腫瘤特異性T細胞的方法。研究發現，輸注TIL后腫瘤發生退縮是由靶向腫瘤特異性抗原（也稱新抗原）的T細胞（即新抗原反應性T細胞）介導的[23]。同樣，免疫檢查點抑制劑發揮療效也可能是通過這些新抗原反應性T細胞實現的[24-25]。富集這些新抗原反應性T細胞進行體外擴增和回輸可能增加療效。獲得TIL需要進行腫瘤組織活檢，這就限制了TIL的應用。PD-1和4-1BB可被用作新抗原反應性T細胞的標記物[26-27]，通過檢測外周血淋巴細胞中PD-1的表達可以識別惡性黑色素瘤患者外周血中的新抗原反應性T淋巴細胞[28]，這就為采用非侵襲性方法進行T細胞為基礎的個體化治療提供了新的策略。此外，靶向新抗原的個體化疫苗可激活之前已存在的以及全新的新抗原特異性T細胞免疫[29]。這些經過腫瘤疫苗或免疫檢查點抑制劑治療后產生的腫瘤反應性T細胞的抗原特異性更強，有望進一步提高TIL治療的臨床療效。上述研究多僅限于實驗室階段，一項在Clinical Trial注冊的、評估TIL治療實體瘤有效性和安全性的2期臨床試驗（NCT03935893）目前正處于患者招募階段。

1.3 CAR-T

CAR-T療法是利用基因工程技術將識別某種抗原分子的抗體可變區（scFv）基因序列與TCR的胞內區序列拼接后，通過逆轉錄病毒、質粒等載體轉染至T淋巴細胞內，并表達融合蛋白[即嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）]于T細胞表面，再通過非MHC限制性的方式識別特定抗原，發揮殺傷腫瘤細胞的作用[30]。CAR-T至今已發展至第5代[31]，第一代CAR-T對腎癌[32]、卵巢癌[33]等實體瘤的療效均不理想。關于第二、三代CAR-T對實體瘤的療效也少有成功的報道，Morgan等[34]報道1例使用第三代CAR-T技術治療1例結腸癌合并肝肺轉移患者出現“細胞因子風暴”而導致死亡的嚴重不良事件。第四代CAR-T[35]使CAR作為一種載體表達CK，但是，對于CK的毒性，無法很好地預測和處理。第五代CAR-T在第四代CAR-T的基礎上進行改進后，使T淋巴細胞僅在激活時釋放CK，相對減少了CK的相關毒性。CAR-T療法對非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病及多發性骨髓瘤等血液系統腫瘤有良好療效[36]。目前，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的兩款CAR-T產品均通過靶向B細胞表面CD19抗原用于治療B細胞白血病，但CAR-T在實體瘤中的應用相對較少。目前，研究發現其主要原因包括以下3點：①CAR-T細胞進入實體瘤時需要克服缺氧、低PH值及營養供應缺乏的微環境[37]，此種腫瘤微環境會抑制CAR-T細胞的長期存活并發揮作用。②實體瘤的抗原特異性遠高于血液系統腫瘤，在實體瘤中很難找到一個表達于所有腫瘤細胞的抗原靶點[38]，這也是目前CAR-T在實體瘤中應用的最大困難。③CAR-T細胞進入實體瘤需要趨化因子輔助，然而，研究表明，實體瘤微環境中的趨化因子與CAR-T不匹配[39]。雖然CAR-T在實體瘤中幾乎未應用，但已有的動物實驗和臨床Ⅰ期試驗結果顯示，CAR-T細胞療法治療癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）陽性的消化道實體瘤患者具有較高的安全性，經多次輸注CAR-T細胞后，部分患者的腫瘤明顯縮小，大部分患者血清CEA的濃度明顯降低[40-41]。另外，靶向CEA的CART聯合IL-2[42]、靶向間皮素（mesothelin，MSLN）及其亞型的CAR-T[43-44]、靶向NKG2D[45]的CAR-T均在胃癌動物模型中具有明顯的抗腫瘤活性。一些新的CAR-T相關試驗及探索如雙特異性T細胞銜接子基因編輯的T細胞技術（bispecific T cell engager T cell，BiTE-T）[46]、重新設計CAR-T成雙靶點[47]、串聯[48]及通用CAR-T[49]均在研究之中。但是，尚無已完成的胃癌相關CRA-T臨床試驗，目前已注冊的與胃癌相關的CRA-T臨床試驗共10項（NCT02744287、NCT03960060、 NCT02713984、 NCT03941626、NCT03941626、 NCT02349724、 NCT02617134、NCT03563326、NCT03890198、NCT02725125），大部分試驗仍處于受試者招募階段。

1.4 TCR-T

隨著基因工程的進步，針對過繼細胞治療靶向性不足的問題，研究人員對T淋巴細胞的T細胞受體（T-cell receptor，TCR）基因進行修飾或使其表達人工設計的抗原受體，從而提高T淋巴細胞對腫瘤細胞的特異性識別和結合能力。早先的方法是使T細胞表達的TCR能靶向腫瘤中呈高表達但在正常組織中也能表達的腫瘤相關抗原，如MART-1、gp100、MAGE-A3和CEA等，其療效和安全性均較差。研究發現，靶向紐約食管鱗狀上皮癌抗原1（New York-esophageal squamous cell carcinoma 1，NY-ESO-1）的高親和力的TCR-T療法在轉移性或復發的黑色素瘤、滑膜肉瘤或骨髓瘤中的反應率分別為55%、61%，且無嚴重不良反應，有可能成為第一個被批準用于臨床的轉基因TCR-T產品[50-51]。研究發現，新抗原反應性T細胞才是主要的效應細胞，因此，TCR研究的方向集中到了針對新抗原而非自身抗原[23]。靶向新抗原的TCR-T有更高的選擇性和親和力，有可能增強抗腫瘤效應，且不良反應更少。然而，TCR-T和TIL的殺瘤效應是MHC限制性的，MHC分子在腫瘤細胞中的表達通常被下調，因此，限制了其發揮療效。目前，在Clinical Trial注冊的實體瘤TCR-T臨床試驗共有25項，其中，與胃癌有關的5項研究均處于招募階段（NCT03941626、NCT03139370、 NCT03686124、 NCT02650986、NCT03190941）。

2 ACT 治療胃癌存在的問題及可能的解決措施

相比于血液系統腫瘤，ACT療法在胃癌及其他實體瘤中面對的障礙更多、更復雜。首先，輸注的T細胞必須能到達并浸潤至腫瘤組織中。到達腫瘤組織后，T細胞還面對著一個免疫抑制的環境，其中包括免疫抑制細胞（如調節性T細胞、腫瘤相關巨噬細胞、髓源性抑制細胞等）、乏氧、壞死、營養缺乏以及一系列免疫抑制分子[如程序性死亡受體配體 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）][52-53]。此外，腫瘤患者的腫瘤環境或引流淋巴結中具有免疫調節活性的多種酶如精氨酸酶1、誘生型一氧化氮合酶、吲哚胺2,3雙加氧酶（indoleamine 2,3 dioxygenase，IDO）等的表達發生上調，這些均會導致T細胞活化不足和（或）T細胞抑制，使腫瘤特異T細胞效應在循環中和腫瘤組織中不能持久，從而限制ACT的療效。此外，若腫瘤持續存在，持續的抗原暴露可導致內源性T細胞耗竭。最后，即使T細胞能在免疫抑制的腫瘤環境中存活并維持其效應功能，腫瘤抗原或抗原呈遞途徑中的成分丟失可導致抗原陰性的腫瘤大量生長從而發生免疫逃逸。克服上述障礙的策略：①優化過繼性T細胞的結構，增加T細胞在腫瘤組織中的穿透性，提高T細胞在腫瘤或血液循環中的擴增能力，并增加其持久性[54]，或富集具有干細胞特征的T細胞，縮短體外擴增時間，并與細胞因子或抗原共同培養，延遲T細胞分化，增加持久性[55]。②由于輸注的腫瘤特異性T細胞會上調共抑制受體如PD-1、T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunolobulin and mucin-containing protein-3，TIM-3）、淋巴細胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）和CD200的表達，而腫瘤細胞可通過T細胞活化介導的輔助性T細胞1（helper T cell 1，Th1）細胞因子的釋放產生共抑制配體，如PD-L1。CAR-T療法和免疫檢查點抑制劑（多為PD-1/PD-L1）聯合治療可能是一種避免免疫抑制的方法[56]。通過基因編輯技術[57-58]去除T細胞上PD-1基因的相關臨床研究正在進行（NCT03399448）。靶向纖維母細胞活化蛋白（幾乎表達于所有實體瘤細胞）的CAR-T亦正在進行臨床研究[59]。③對T細胞進行修飾使其能產生白細胞介素-15（interleukin-15，IL-15）等細胞因子，表達CD40L等共刺激配體，或分泌阻斷檢測點的單鏈可變區片段（single-chain variable fragment，scFv）等。這些新的基因工程T細胞被稱為通用細胞因子介導殺傷的重定向T細胞（T cell redirected for universal cytokine-mediated killing，TRUCK）或“武裝的”T細胞，可以保留T細胞強大的殺瘤活性，并提高持久性。④針對新抗原的特異性T細胞能夠減少毒性，增加療效[60]。然而，實體瘤的CAR-T多靶向腫瘤相關抗原，可設計具有適當親和力的CAR變異體，能根據靶抗原表達水平的不同區分腫瘤細胞和正常細胞[61]。低親和力的CAR可對高表達腫瘤相關抗原的腫瘤細胞產生強烈的細胞毒效應，而對低表達腫瘤相關抗原的正常細胞，其毒性輕微或無毒性[62-63]。采用基因編輯技術破壞細胞表面TCR[防止移植物抗宿主排斥反應（graft ver-sus host reaction，GVHR）]和β2微球蛋白（beta 2 microglobulin，β2M）或HLA-I分子（防止移植排斥反應）的表達[57,64-65]，可實現同種異體T細胞的輸注，用于淋巴細胞缺乏或身體狀況差的患者。

3 小結與展望

近年來，ACT尤其是TCR-T、CAR-T治療腫瘤的研究進展很快，在某些腫瘤中已顯示出很好的療效，但對實體瘤的療效仍有限。如何增加效應T細胞的功能、優化T細胞的生產、減少臨床毒性與T細胞耗竭及避免腫瘤微環境的免疫抑制以達到臨床應用是ACT研究需要迫切解決的問題。免疫治療是目前腫瘤治療的手段之一，將來有可能成為腫瘤治療的基本手段。未來的方向可能是根據胃癌腫瘤微環境中不同的免疫狀態給予不同的免疫治療策略，例如：對于腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）高的患者，可考慮選擇免疫檢查點抑制劑和TIL[24]；對于TMB低的患者，可考慮高親和力的TCR-T；若有合適的腫瘤表面標記，則可考慮CAR-T。在免疫治療的基礎上聯合其他治療手段如化療、靶向治療、放療等有望成為將來腫瘤治療的最佳策略。