鐵死亡調控機制及其在腫瘤治療中的研究進展

阿依加馬力·麥麥提，梁靚，管曉翔,3#

1南京大學醫學院，南京 210093

2江蘇省人民醫院句容分院血液腫瘤科，江蘇 句容 212400

3江蘇省人民醫院腫瘤科，南京 210029

2012年，Dixon等[1]首次發現鐵死亡。鐵死亡在形態、生化和遺傳上與其他為人熟知的自噬和凋亡不同。細胞凋亡中的染色質固縮和邊緣化及聚ADP核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose)polymerase 1，PARP1]裂解、線粒體釋放的細胞色素c或caspase 3裂解、細胞自噬中的雙層膜結構的自噬小泡、細胞器的腫脹、核膜和細胞膜的溶解等典型的特征在鐵死亡中均沒有出現。此外，由于發生鐵死亡時，細胞膜或細胞器膜脂質過氧化和氧化應激，導致質膜選擇滲透性喪失，線粒體形態發生特殊而獨特的變化，包括線粒體嵴減少或消失、線粒體外膜破裂、線粒體膜濃縮[2]。

研究表明，人和動物不同的生理和病理應激狀態均可引起鐵死亡[1]。鐵死亡可消除惡性細胞的適應性特征，去除無法獲取關鍵營養因子或受感染及因環境改變而損傷的細胞，在抑制腫瘤發生中起關鍵作用。經典的氧化應激途徑是誘發鐵死亡的一個重要原因。雖然腫瘤細胞處于持續的氧化應激狀態，但鐵死亡潛在的分子機制仍未清楚。本文對腫瘤細胞中鐵死亡的發生和調控機制進行綜述，并詳細介紹以鐵死亡為基礎的腫瘤治療所面臨的機遇和挑戰，為腫瘤治療探索具有臨床價值的新策略。

1 鐵死亡調控機制

近10年來，活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）一直是腫瘤研究領域的熱點。細胞內的ROS主要由線粒體呼吸鏈產生，內質網、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶復合體（NADPH oxidase，NOX）等也可以通過一系列化學反應產生ROS。正常情況下，氧化-抗氧化體系將ROS維持在一定的范圍，超過正常范圍則會導致腫瘤。鐵死亡過程的主要特點是脂質活性氧（lipid-ROS，L-ROS）和來自鐵代謝的致命ROS的積累，且可通過鐵螯合劑和脂質過氧化抑制劑抑制。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）、熱休克蛋白β1（heat shock protein β1，HSBP1）和核因子相關因子 2（nuclear factor-f2，Nrf2）通過限制ROS產生和減少細胞對鐵的攝取而對鐵死亡起負調控作用。NADPH氧化酶和P53通過促進ROS產生發揮正調控作用[2]（圖1）。

圖1 鐵死亡調控機制

1.1 鐵死亡主要機制

L-ROS積累主要由GPX4活性喪失引起[3]，兩種不同的機制介導此過程：①是抑制胱氨酸/谷氨酸逆轉運蛋白體（system xc-），通過system xc-細胞內的谷氨酸與細胞外的胱氨酸按照等比互換，可間接誘導GPX4失活。半胱氨酸（胱氨酸的還原形式）是谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成的前體，GSH是GPX4發揮磷脂過氧化物酶活性并催化脂質過氧化物還原過程的主要輔助因子。因此，抑制system xc-會導致GSH耗竭并隨后使GPX4失活（圖1），最終導致L-ROS聚集從而引發鐵死亡。②是鐵死亡誘導劑直接抑制GPX4的酶促活性，在鐵死亡的概念提出之前，研究者就發現了鐵死亡誘導因子。2003年，研究發現了突變型大鼠肉瘤癌基因（rat sarcoma oncogene，RAS）表達的人包皮成纖維細胞BJeLR中參與合成致死的誘導因子Erastin[4]。system xc-是由溶質載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）和溶質載體家族 3成員 2（solute carrier family 3 member 2，SLC3A2）組成的，研究證明，Erastin通過抑制SLC7A11而間接抑制GPX4的活化，破壞了細胞內氧化還原的穩定性及L-ROS聚集。隨后，在2008年的另一項高通量小分子篩選研究中鑒定了RSL3，可以直接抑制GPX4的活性以非凋亡的形式選擇性殺死BJeLR細胞[5]（圖1），且小分子抑制劑不能逆轉RSL誘導的細胞死亡。相反，抗氧化劑和鐵螯合劑可阻斷RSL誘導的細胞死亡。因此，也進一步證明鐵死亡是一種鐵依賴性細胞死亡。

1.2 鐵代謝

已經證實，與鐵代謝相關的基因是鐵死亡過程中的關鍵介質（圖1），如轉鐵蛋白（transferrin，Tf）、轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TfR1）、鐵卟啉（iron porphyrin，FPN）、二價金屬離子轉運體1（divalent metal transporterq， DMT1， 又 稱SLC11A2）、鐵蛋白重鏈（ferritin heavy chain 1，FTH1）、鐵蛋白輕鏈（ferritin light chain，FTL）等。Fe3+通過TfR1進入細胞，定位于內胚層，并通過金屬還原酶家族3（six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 3，STEAP3）的鐵還原酶還原為Fe2+。最后，SLC11A2促進Fe2+釋放到細胞質上的不穩定鐵池中，通過Fenton反應介導ROS產生[6]，多余的鐵儲存在鐵蛋白中。膜鐵轉運蛋白（鐵外排泵，也被稱為SLC11A3）將Fe2+氧化為Fe3+輸出。

學者對發生鐵依賴性死亡的細胞研究發現，TfR1增加和鐵蛋白（FTL和FTH1）表達下調，是鐵死亡的細胞中鐵超載的原因。鐵螯合劑通過限制鐵超載從而抑制鐵死亡，而供應外源性鐵可促進鐵死亡。研究顯示，蛋白62（protein 62，p62）/Kelch樣ECH聯合蛋白1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）/Nrf2抗氧化信號通路是通過轉錄激活活性氧和鐵代謝相關基因而抑制鐵吸收[7]（圖1）。相反，HSP27的磷酸化阻斷鐵吸收從而抑制鐵死亡。蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）介導HSPB1的磷酸化，并通過抑制ROS產生和減少鐵吸收從而成為鐵死亡的負調節劑[8]。

1.3 P53參與鐵死亡

研究表明，P53與鐵死亡機制相關（圖1），P53可直接抑制system xc-的關鍵成分SLC7A11的轉錄而抑制細胞對胱氨酸的攝取。此外，乙酰化缺陷突變體小鼠缺乏細胞周期阻滯、凋亡或衰老的功能，但可以通過抑制SLC711A的表達而誘導鐵死亡，仍具有腫瘤抑制功能[9]。在某些特定條件下，P53的表達可能促進、限制或延緩鐵死亡的開始。P53在細胞鐵依賴性死亡過程中的這些作用是通過不同機制實現的，如P53對代謝基因轉錄、翻譯后調控或對P53-P21軸的影響等[10]。P53以細胞特異性或環境依賴性的方式對鐵死亡的雙向調節需要進一步研究。

1.4 其他機制

Erastin除通過抑制system xc-和鐵通過Fenton反應介導ROS產生外，還有很多種途徑產生ROS并引發鐵死亡。電壓依賴性陰離子通道2（voltagedependent anion channel 2，VDAC2）/VDAC3信號轉導通路在線粒體外膜上控制腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的跨膜流動。微管蛋白可以通過阻斷VDAC2/VDAC3信號轉導通路抑制線粒體代謝，從而促進有氧糖酵解（是腫瘤細胞主要的能量來源）。Erastin具有直接抑制微管蛋白的功能，使VDAC2/VDAC3處于開放狀態并恢復線粒體代謝，誘導活性氧的產生[11]（圖1），最終誘導細胞以獨特的鐵依賴性、非凋亡形式死亡。此外，鐵死亡誘導劑可以誘導線粒體上的戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，PPP）產生 NADPH，通過 NOX氧化酶將電子轉移并氧轉化為過氧化物。此外，谷氨酰胺轉化為α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）可產生ROS。

德國學者研究發現，脂代謝相關的長鏈脂酰輔酶A合成酶家族成員4（long-chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4）是鐵死亡中的關鍵蛋白之一[12]。花生四烯酸和腎上腺酸是多不飽和脂肪酸底物，ACSL4可酰基化花生四烯酸和腎上腺酸，使其成為膜磷脂的一部分，易被氧化成脂質ROS，而GSH和GPX4對其有還原作用。RSL3可以直接抑制GPX4，導致這些脂質ROS的積聚和脂質過氧化，從而引發鐵死亡[12]（圖1）。半胱氨酰轉運RNA（transfer RNA，tRNA）合成酶可以剝奪胱氨酸，減少GSH的合成，使GPX4失活，從而產生ROS誘導鐵死亡[13]。

1.5 非編碼RNA 在細胞鐵死亡中的作用

越來越多的學者認為，微小RNA（microR NA，miRNA）和長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是調控鐵死亡的關鍵介質（表1）。研究發現，肺腺癌中的P53RRA異常低表達。P53與RNA結合蛋白（G3BP1）結合[14]，P53RRA與G3BP1的RNA識別基序結構域相互作用，將P53與其分離并使細胞核中的P53保存更多，通過P53途徑增加鐵和脂質ROS的濃度。從而得知，P53RRA-G3BP1是肺腺癌中誘導鐵死亡的一種新的機制，肺腺癌組織中P53RRA表達水平越低，肺腺癌患者的預后就越差。

在黑色素瘤細胞系G-361和A375中，miRNA-9可以通過靶向谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶1（glutamate oxaloace-tate transaminase 1，GOT1）來抑制鐵死亡。GOT1是分解葡萄糖，并將其轉化為α-KG的酶，其可促進ROS的積累并誘導鐵死亡。另一項研究表明，miRNA-137可直接抑制SLC1A5來阻止鐵死亡，而SLC1A5是葡萄糖攝取的主要受體。因此，通過敲除miRNA-9和miRNA-137，可提高α-KG的水平并促進葡萄糖的攝取，從而提高腫瘤細胞對鐵死亡的敏感性。

SLC7A11在鐵死亡的負調控中發揮關鍵作用。研究表明，miRNA-375、miRNA-27a、miRNA-26b和As-SLC7A11（反義lncRNA）能抑制SLC7A11的轉錄，降低其蛋白強度[15]。因此，這些miRNA可以通過靶向SLC7A11來促進鐵死亡。

由于Nrf2具有抑制鐵吸收、限制ROS生成和上調SLC7A11表達的功能，因此，Nrf2也是鐵死亡的重要抑制劑。首先，miRNA-7和miRNA-200a通過抑制Keap1的表達，激活Nrf2途徑[16]；相反，miRNA-28以不依賴Keap1的方式抑制Nrf2的表達[17]。其次，miRNA-101和miRNA-455均可通過靶向Cullin-3（Cul3）來促進Nrf2的表達[18]。最后，miRNA-153、miRNA-142-5p、miRNA-27a、miRNA-144、miRNA-93、miRNA-34a、miRNA-365-1、miRNA-193b和 miRNA-29-b1[18]可通過不同機制降低Nrf2的水平。這些結果表明，miRNA可以通過調節Nrf2的表達來影響鐵死亡。

根據現有的研究結果得知，miRNA還參與鐵的轉運、儲存、利用和吸收的調控。miRNA-20a和miRNA-485-3p可以通過靶向FPN基因來降低鐵產量[19]，miRNA-210和miRNA-152抑制TfR1的表達，從而減少對Tf的吸收。同時，miRNA-200b和miRNA-Let-7d的表達分別通過抑制FTH和DMT1-IRE的表達有效減少了鐵的積累。

2 鐵死亡是程序性細胞死亡的擴展網絡

近5年，我們對鐵死亡的認識得到了驚人的提高，鐵死亡與細胞凋亡、自噬和其他程序性壞死之間的作用都已進行了初步研究。

表1 與鐵死亡相關非編碼RNA的表達情況

2.1 鐵死亡和細胞凋亡：轉換、協同還是拮抗作用？

越來越多的研究表明，P53除通過細胞周期停滯和誘導細胞凋亡來預防腫瘤發生外，還可以在某些條件下誘導鐵死亡。張先正教授等設計了一種新型的P53復合物——MON-P53[20]。MON引起Fenton反應調節ROS積累，P53抑制SLC7A11誘導GSH清除引起鐵死亡，還能調節凋亡途徑引起細胞凋亡，從而限制腫瘤的生長及延長腫瘤切除小鼠的壽命。因此，該方法將指導鐵死亡和細胞凋亡混合抗腫瘤治療。

青蒿琥酯和Erastin之類的鐵死亡誘導因子可以誘導未折疊的蛋白應答，該蛋白通過C/EBP同源蛋白（CAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP）促進P53上調促凋亡因子（P53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA）的表達[21]。PUMA可以增強腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的表達來促進細胞凋亡。通過觀察TRAIL誘導的細胞凋亡作用可以證實鐵死亡誘導劑與TRAIL聯合能明顯提高對腫瘤細胞的殺傷作用。

另一種觀點認為，刺激鐵死亡相關的代謝在生化方面會抑制凋亡的發生。由于胱氨酸減少而發生鐵死亡的細胞，其細胞內GSH含量約為正常水平的10%。GSH的還原能力是caspases 3和caspases 8激活的必要條件，因此，細胞缺乏GSH不能正確激活caspase，從而抑制細胞凋亡。

2.2 自噬降解鐵蛋白可以促進鐵死亡

自噬是一種依賴溶酶體的降解途徑。自噬途徑的激活可以降解鐵蛋白，然后觸發腫瘤細胞的鐵死亡[22]，也可以通過溶酶體ROS的產生促進鐵死亡，還可以通過NCOA4介導的鐵蛋白自噬為鐵死亡提供不穩定鐵。敲除自噬相關基因Atg5和Atg7通過減少脂質過氧化和細胞內Fe2+水平，從而限制鐵死亡。

最近的研究表明，細胞因子信號轉導抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）是P53基因的直接調節和調控細胞衰老所必需的重要因子，而P53可抑制SLC7A11轉錄，從而抑制GSH的攝取。SOCS1可以通過調控P53，使細胞對鐵死亡敏感[23]。盡管不同類型調控細胞死亡的機制具有不同的形態學和生化特征，但在調控因子與這些不同過程的組成部分之間仍存在一些干擾。

3 鐵死亡在不同腫瘤治療中的調控機制

NCI-60是一組由8種不同組織類型組成的不同腫瘤細胞系，其中彌漫性大B細胞淋巴瘤和腎細胞癌細胞比其他6個組織（乳腺癌、肺癌、結腸癌、黑素細胞癌、中樞神經系統癌和卵巢癌）的腫瘤細胞更易發生Erastin誘導的鐵死亡。由于基本代謝狀態的不同，不同細胞系對鐵死亡的敏感性也不同。大量研究證實，如阿糖胞苷、順鉑、阿霉素和替莫唑胺等化療藥物與Erastin聯合應用對其抗腫瘤活性有明顯的協同作用，患者的預后優于單純傳統化療。

3.1 肝細胞癌

鐵死亡是索拉非尼治療肝細胞癌的潛在機制之一。肝細胞癌組織中視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，Rb）水平明顯降低，索拉非尼處理的肝細胞癌細胞中Rb蛋白更容易失活。抑制system xc-和GSH耗竭是索拉非尼誘導鐵死亡的主要機制。Rb蛋白失活導致線粒體中ROS濃度增加并增強肝細胞癌細胞的氧化應激反應，提高其對鐵死亡的敏感性。MT-1G是肝細胞癌中一種新型的鐵死亡負調節劑，敲除MT-1G可通過增加脂質過氧化作用和GSH耗竭而導致鐵死亡。低密度脂蛋白-二十二碳六烯酸納米顆粒通過鐵死亡途徑導致肝細胞癌細胞死亡。過度活躍的P62/keap1/Nrf2途徑由于Nrf2的靶基因，包括血紅素加氧酶-1（HO-1）、FTH1和醌氧化還原酶1[NAD(P)H：quinine oxidoreductase 1，NQO1]可以直接抑制ROS的積聚（圖1），從而削弱鐵死亡過程[24]。

3.2 胃癌

Hao等[25]發現，Erastin可以誘導胃癌細胞發生鐵死亡。鐵死亡抑制劑（F-1和L-1）可以抑制CDO1，從而恢復GPX4的表達和GSH水平，最終減少ROS的生成來逆轉Erastin誘導的鐵死亡。CD44是在腫瘤干細胞中表達的黏附分子。研究發現，CD44突變體（CD44v）可與system xc-相互作用，調控細胞內GSH的水平。因此，CD44高表達的人胃腸道腫瘤細胞GSH合成能力高，進而可以阻斷ROS誘導的應激信號傳導，使胃癌細胞對鐵死亡產生抵抗[26]。

3.3 卵巢癌

卵巢癌細胞對鐵死亡的敏感性很高，因為其腫瘤起始細胞TICs中鐵水平過高，TFR1過表達，鐵外排泵FPN水平過低[27]。青蒿琥酯是一種耐受性良好的抗瘧疾藥物，也具有抗腫瘤活性。研究發現，采用青蒿琥酯處理的卵巢癌細胞發生ROS與鐵依賴性細胞死亡，并且鐵死亡抑制劑F-1可有效阻止這一過程[28]。

3.4 乳腺癌

Ma等[29]研究顯示，西拉美新和拉帕替尼通過增加鐵依賴性ROS的產生來誘導鐵死亡。CDO1過表達會降低乳腺癌細胞中GSH水平，導致ROS的進一步積累從而加劇鐵死亡[30]。相反，MUC1-C可以通過與CD44v形成復合物來增加半胱氨酸的攝取并上調GSH的表達，可抑制乳腺癌細胞鐵死亡過程。三陰性乳腺癌中ACSL4的表達水平較高，其可以通過參與脂質ROS的積聚和脂質過氧化而引發鐵死亡。

3.5 肺癌

Erastin在KRAS突變的A549細胞中首次誘導肺癌細胞鐵死亡。研究顯示，Erastin通過減少GSH和GPX4滅活引發鐵死亡。順鉑也是一種鐵死亡誘導劑，其機制與Erastin相似。此外，順鉑聯合Erastin治療肺癌的抗腫瘤活性存在明顯的協同作用[27]。半胱氨酸脫硫酶（cysteine desulfurase，NFS1）作為鐵硫簇生物合成酶，通過維持鐵硫輔因子，可以在高氧張力下保護細胞免受鐵死亡。

3.6 橫紋肌肉瘤

橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RMS）是一種影響兒童和青少年的肌源性腫瘤，對其發病機制的研究甚少。固有的RAS/ERK信號通路是發生RMS的主要驅動因素之一，此通路的激活與腫瘤侵襲性和氧化應激水平相關。最近的研究表明，高表達的GSH在RMS細胞生長和RMS多藥耐藥性研究中至關重要。鐵死亡誘導劑RSL3和Erastin可使GPX4耗竭并降低GSH水平，從而誘導RMS13細胞鐵死亡并可以明顯阻止腫瘤的進展。

3.7 血液惡性腫瘤

一項研究從各種組織收集8種細胞系，其中彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞是對鐵死亡誘導劑最敏感的細胞之一[3]。研究證明，GPX4過表達是彌漫性大B細胞淋巴瘤預后的獨立預測因子。此外，體外分析表明，GPX4過表達細胞對ROS誘導的細胞死亡具有抵抗力。相反，GPX4基因敲除細胞對ROS誘導的細胞死亡敏感。上述研究表明GPX4調節ROS誘導的細胞死亡過程[31]。

急性髓系白血病（acute myeloblastic leukemia，AML）是成年人最常見的白血病類型。研究顯示，Erastin以一種與RAS無關的方式增強AML細胞對化療藥物的敏感性。Erastin劑量依賴性地誘導HL-60細胞（AML，NRAS_Q61L）中與鐵死亡、凋亡、壞死和自噬相關的混合型細胞死亡。鐵死亡抑制劑或細胞壞死抑制劑可防止Erastin誘導的細胞死亡，但Z-VAD-FMK（一種通用的caspase抑制因子）或氯喹（一種有效的自噬抑制因子）則不會防止。重要的是，小劑量Erastin明顯增強了兩種一線化療藥物（阿糖胞苷/阿糖胞苷和阿霉素）對HL-60細胞的抗腫瘤活性。總之，誘導鐵死亡和壞死有助于Erastin抑制AML細胞生長和克服耐藥性[32]。

4 小結與展望

綜上所述，目前，根除殘留或耐藥腫瘤細胞在腫瘤治療的相關研究中至關重要，鐵死亡作為一種新型細胞死亡形式為腫瘤治療提供了一個新的治療策略。有研究報道，獲得間充質細胞狀態（如上皮-間充質轉化或腫瘤干細胞）與腫瘤細胞轉移及擴散、耐藥和化療抵抗有密切關系[33]。高間充質狀態的腫瘤細胞存活依賴于GPX4，并且高間充質狀態是獲得性和非獲得性抗靶向治療的重要機制。阻斷GPX4將直接導致鐵死亡，持續存在的腫瘤細胞通過腫瘤休眠狀態擺脫常規治療的細胞毒性，此狀態也對GPX4通路有相同的選擇依賴性。因此，鐵死亡可能是逆轉腫瘤細胞耐藥性的可行策略。鐵死亡比細胞凋亡更具免疫原性，鐵死亡細胞通過DAMP釋放炎性相關的損傷分子（如HMGB1）促進炎癥的發生[34]，還可通過傳遞趨化性信號在腫瘤部位招募和激活免疫細胞，這說明鐵死亡誘導劑很有可能對抗腫瘤免疫治療有促進作用。

雖然鐵死亡在腫瘤治療中效益明顯，但如何從分子水平上解釋鐵死亡與其他細胞死亡之間的相互聯系，鐵死亡是否跟細胞壞死一樣增強細胞對宿主的免疫原性，從而引起適應性免疫反應；在臨床前或臨床試驗中，是否通過鐵死亡誘導劑來有效殺死腫瘤細胞等一系列問題仍需要進一步研究。