沙糖橘S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因克隆及表達分析

唐文武 吳秀蘭

摘要：【目的】克隆沙糖橘S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因（CrSAMDC），并明確其在不同組織和干旱脅迫下的表達特征，為開展SAMDC基因分子機理研究提供理論依據，同時為柑橘抗逆分子育種提供候選基因。【方法】以6年生沙糖橘為材料，利用RT-PCR克隆CrSAMDC基因并進行生物信息學分析，以實時熒光定量PCR檢測CrSAMDC基因在不同組織和干旱脅迫下的表達譜，并開展原核誘導外源蛋白表達及Southern雜交分析。【結果】從沙糖橘嫩葉克隆獲得的CrSAMDC基因cDNA序列全長1736 bp，含有1個1131 bp的開放閱讀框（ORF），編碼376個氨基酸殘基;CrSAMDC蛋白相對分子量為40.69 kD，理論等電點（pI）為5.27，為親水性蛋白，其二級結構以α-螺旋和無規則卷曲為主，分別占32.98%和42.02%，β-轉角僅占6.91%，延伸鏈占18.09%;與克里曼丁橘（Citrus clementina，XP_024047984.1）和甜橙（C. sinensis，KDO62315.1）的SAMDC蛋白親緣關系較近，其氨基酸序列同源性分別為99.5%和97.3%;具有LSE-SSLF的酶原剪切位點結構域及與SAMDC蛋白降解相關的PEST結構域（TVHITPED-GFSYASYE）。CrSAMDC基因在沙糖橘的葉、花、果肉和果皮中均有表達，且在分裂旺盛的嫩葉和花器官中高表達;干旱脅迫下，CrSAMDC基因表達量呈先上升后下降的變化趨勢，以干旱脅迫后24 h的相對表達量最高。CrSAMDC基因在沙糖橘基因組中以單拷貝形式存在，且通過構建原核表達載體能成功誘導表達獲得CrSAMDC融合蛋白。【結論】CrSAMDC基因在沙糖橘中的表達具有組織特異性，且以單拷貝存在，在干旱脅迫下呈上調表達趨勢，即參與干旱脅迫響應的多胺代謝調控。

關鍵詞： 沙糖橘;CrSAMDC基因;多胺;干旱脅迫;原核表達;Southern雜交

Abstract：【Objective】The S-adenosylmethionine decarboxylase gene（CrSAMDC） was cloned from Shatangju， and the expression characteristics of the CrSAMDC gene was analyzed in different tissues and under drought stress. This provided basis for further molecular mechanism of SAMDC gene and provided candidate genes for Citrus stress resistant molecular breeding. 【Method】CrSAMDC gene was cloned by using reverse transcriptional PCR（RT-PCR） with six-year Sha-tangju as materials. Bioinformatics was conducted as well. Real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR） method was adopted to study the expressions of CrSAMDC gene in different tissues and under drought stress. Prokaryotic induction exogenous protein expression and Southern blot analysis were conducted. 【Result】The cDNA full-length sequence of CrSAMDC gene cloned fron Shatangju new leaves was 1736 bp， with an open reading frame（ORF） of 1131 bp， encoding 376 amino acids. CrSAMDC protein relative molecular weight was 40.69 kD， theoretical isoelectric point（pI） was 5.27. It was a hydrophilic protein. Its secondary structure was mainly consisted of α-helix（32.98%） and random coil（42.02%）， β-turn only accounted for 6.91%， and extended chain accounted for 18.09%. It had the close genetic relationship with SAMDC protein of Citrus clementina（XP_024047984.1） and C. sinensis（KDO62315.1）， their amino acid sequence homology were 99.5% and 97.3%.? It had LSE-SSLF prozyme cleavage site domain and PEST domains related to SAMDC protein degradation（TVHITPED-GFSYASYE）.? CrSAMDC gene was expressed in leaves， flowers， flesh and peel of Shatangju， and was highly expressed in young leaves and flowers with vigorous division. Under drought stress， the expression level of CrSAMDC gene first increased and then decreased， and the highest expression level was reached at 24 h.? CrSAMDC gene exists as a single copy， and CrSAMDC fusion protein could be obtained through induction of prokaryotic expression vector. 【Conclusion】The expression of CrSAMDC gene in Shatangju has tissue specificity， and exists as single copy. It up-regulates its expression under drought stress， which means that involves in the regulation of polyamine metabolism in response to drought stress.

Key words： Shatangju; CrSAMDC gene; polyamine; drought stress; prototypical expression; Southern blot analysis

0 引言

【研究意義】多胺在調控植物生長發育和緩解逆境脅迫等方面發揮重要作用，S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC）作為多胺合成的關鍵限速酶，主要參與植物防御干旱脅迫的調控過程（郝愛平和王婷婷，2014;Wi et al.，2014）。沙糖橘是我國南方主栽的柑橘品種，多種植于丘陵山地等干旱缺水地區，易受干旱和低溫等氣候影響及病蟲害威脅，尤其是近年來全球氣候變暖，導致持續高溫干旱和缺乏降雨等異常氣候頻發，對我國柑橘生產造成嚴重影響（王靜，2009;李果果等，2018）。因此，開展沙糖橘SAMDC基因克隆及表達分析，對研究柑橘的抗逆分子機理及遺傳改良具有重要意義。【前人研究進展】多胺是由兩個或兩個以上氨基組成具有促進細胞分裂分化的低分子脂肪族含氮堿，在生物體內廣泛分布，具有刺激生長和延緩衰老的作用（張雪梅等，2012）。植物中的多胺主要以腐胺（Putrescine，Put）、尸胺（Cadavarine，Cad）和亞精胺（Spermidine，Spd）等形式存在，在調控植物生長發育、抗逆性、形態建成及延緩衰老等方面發揮重要作用（Bouchereau et al.，1999;趙維峰等，2004;Alcázar et al.，2006;Groppa and Benavides，2008）。SAMDC作為精胺和亞精胺合成過程的限速脫羧酶，能催化S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）脫羧并形成氨丙基，然后在精胺合成酶（Spermine synthase，SPMS）催化作用下，提供的氨丙基與腐胺反應生成精胺;或在亞精胺合成酶（Spermidine synthase，SPDS）作用下，氨丙基與腐胺反應生成亞精胺（Kakkar et al.，2000;李亞棟和何近剛，2012）。目前，已在馬鈴薯（Mad Arif et al.，1994）、曼陀羅（Torrigiani et al.，2005）、番茄（Sinha and Rajam，2013）、甘蔗（文樂等，2015）、胡蘿卜（王廣龍等，2017）、陸地棉（梁其干等，2019）和白菜（唐文武和吳秀蘭，2019）等多種植物中分離獲得SAMDC，其作為限速酶調控著植物體內多胺的合成，在植物的抗逆境脅迫、細胞分裂分化、種子萌發及花果發育等過程中發揮重要作用（Minocha et al.，2014）。【本研究切入點】沙糖橘是我國南方地區重要的柑橘品種，但至今有關沙糖橘SAMDC基因（CrSAMDC）的克隆及其功能研究尚無報道。【擬解決的關鍵問題】以無籽沙糖橘為材料，利用RT-PCR克隆CrSAMDC基因并進行生物信息學分析，以實時熒光定量PCR檢測CrSAMDC基因在不同組織和干旱脅迫下的表達譜，并開展原核誘導外源蛋白表達及Southern雜交分析，以期為開展SAMDC基因分子機理研究提供理論依據，同時為柑橘抗逆分子育種提供候選基因。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為廣東地區種植的無籽沙糖橘品種，由肇慶市四會果園提供。選擇生長旺盛的6年生沙糖橘果樹，在不同時期摘取其嫩葉（春梢期）、老葉（越冬期）、花（花芽期）、30 d幼果果肉和30 d幼果果皮，每3株果樹為1個重復，共設3個重復，所有材料取樣后置于-80 ℃冰箱保存，用于總RNA提取。干旱脅迫處理時，采集6年生沙糖橘果樹上的新發秋梢，再以10% PEG-6000對其進行模擬干旱脅迫，脅迫時間分別設為3、6、9、12、24和36 h，以0 h為對照，設3個重復。

1. 2 CrSAMDC基因克隆

1. 2. 1 葉片總RNA提取及cDNA第一鏈合成 取6年生無籽沙糖橘果樹的嫩葉，采用RNAout試劑盒（北京天恩澤基因科技有限公司）提取其總RNA，并以DNaseⅠ（TaKaRa公司）進行消化。采用M-MLV反轉錄試劑盒（Life technology公司）反轉錄合成cDNA第一鏈，具體步驟嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1. 2. 2 引物序列設計及PCR擴增 根據華中農業大學已公布的甜橙（Citrus sinensis）SAMDC基因序列（Gene ID：Cs4g02260）設計并篩選出1對PCR引物CrSAMDC-F/CrSAMDC-R（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司廣州分公司合成。以反轉錄合成的cDNA為模板擴增CrSAMDC基因cDNA序列，PCR反應體系50.0 μL：Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL，10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 2.0 μL，CrSAMDC-F和CrSAMDC-R（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA模板（100 ng）2.0 μL，加ddH2O補充至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性4 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，進行30個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒（TaKaRa公司）回收純化目的片段。

1. 2. 3 CrSAMDC基因測序分析 將CrSAMDC基因與克隆載體pMD19-T連接后，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經培養、質粒DNA提取及PCR鑒定后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1. 3 CrSAMDC蛋白生物信息學分析

利用NCBI對CrSAMDC基因cDNA序列進行編碼蛋白搜索，并以BLAST進行同源比對分析;采用ExPASy中的ProtParam進行CrSAMDC蛋白理化性質分析，使用ProtScale預測其親/疏水性;利用PredictProtein預測CrSAMDC蛋白功能結構域;使用SWISS-MODEL進行CrSAMDC蛋白三級結構預測;最后以DNAMAN和MEGA 7.0進行蛋白序列多重比對及構建系統發育進化樹。

1. 4 CrSAMDC基因在不同組織及干旱脅迫下的表達分析

根據CrSAMDC基因cDNA序列設計1對特異性引物QCrSAMDC-F/QCrSAMDC-R（表1），以柑橘ACTB基因為內參（Wu and Tang，2016），按SYBR熒光定量試劑盒說明進行實時熒光定量PCR檢測，并采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量（Livak and Schmittgen，2001）。

1. 5 CrSAMDC基因原核表達載體構建及融合蛋白誘導表達

設計含有EcoR I和Sal I酶切位點接頭的引物pET32CS-F/pET32CS-R（表1），然后擴增攜帶有酶切位點的CrSAMDC基因。同時以EcoR I和Sal I雙酶切pET32a原核表達載體，并與攜帶酶切位點的Cr-SAMDC基因進行大片段連接，構建重組質粒pET32a-CrSAMDC。經轉化、涂板、雙酶切及測序等鑒定后，將陽性重組質粒pET32a-CrSAMDC轉化至BL21（DE3）原核表達菌株中，以pET32a空載體為對照。將克隆菌株接種至含氨芐青霉素（Amp+）的LB培養基上，37 ℃過夜培養，然后按1∶100比例再接種至LB培養基，37 ℃下搖床（200 r/min）培養至OD600為0.6～0.8，加入1 mmol/L IPTG進行誘導表達，表達產物用12% SDS-PAGE進行電泳檢測。

1. 6 Southern雜交分析

采用CTAB法提取沙糖橘嫩葉基因組DNA（約10 μg），分別用限制性內切酶EcoR I、BamH I、Sac I和Dra I在37 ℃下進行酶切（約12 h），再以0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，具體操作參考Wu和Tang（2016）的方法。探針引物為Southern-F/Southern-R（表1），擴增片段為597 pb，PCR反應體系及擴增程序同1.2.2。

2 結果與分析

2. 1 CrSAMDC基因克隆及測序分析結果

以沙糖橘嫩葉總RNA反轉錄合成的cDNA為模板，利用CrSAMDC-F/CrSAMDC-R引物進行PCR擴增，結果獲得1條約1700 bp的清晰條帶（圖1），與預期結果相符。測序結果顯示，CrSAMDC基因cDNA序列全長1736 bp，含有1個1131 bp的開放閱讀框（ORF），編碼376個氨基酸殘基（圖2）。

2. 2 CrSAMDC蛋白生物信息學分析結果

利用ProtParam對CrSAMDC蛋白理化性質進行預測分析，結果顯示，CrSAMDC蛋白由376個氨基酸組成，相對分子量為40.69 kD，理論等電點（pI）為5.27;其中，絲氨酸（Ser）含量最高，占13.3%，色氨酸（Trp）含量最低，僅占1.1%;正電荷氨基酸殘基[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]41個，占氨基酸總數的10.9%，負電荷氨基酸殘基[精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）]31個，占氨基酸總數的8.2%。ProScale親/疏水性預測結果表明，CrSAMDC蛋白疏水性最強的是第73位亮氨酸（Leu），其分值為1.811;親水性最強的是第163位脯氨酸（Pro），其分值為-2.244;平均親水系數為-0.016，即CrSAMDC蛋白為親水性蛋白。CrSAMDC蛋白二級結構以α-螺旋和無規則卷曲為主，分別占32.98%和42.02%，β-轉角僅占6.91%，延伸鏈占18.09%。使用SWISS-MODEL對CrSAMDC蛋白進行同源建模分析，結果（圖3）表明該蛋白與PDB蛋白結構數據庫中人類SAMDC S68A（1msv.1.A）的相似性為31.35%，全局模型質量評估值（GMQE）為0.62。

利用MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbour-joining，NJ）構建基于SAMDC氨基酸序列同源性的系統發育進化樹，結果（圖4）顯示，CrSAMDC蛋白與克里曼丁橘（C. clementina，XP_024047984.1）和甜橙（KDO62315.1）的SAMDC蛋白親緣關系較近，其氨基酸序列同源性分別為99.5%和97.3%;然后與阿月渾子（Pistacia vera，XP_031285063.1）、博落回（Macleaya cordata，OVA09485.1）、毛白楊（Populus trichocarpa，XP_002324514.2）和番木瓜（Carica papaya，XP_021902142.1）的SAMDC蛋白聚在同一分支上。歐洲栓皮櫟（Quercus suber，XP_023920228.1）、楊梅（Morella rubra，KAB1211990.1）和筍瓜（Cucurbita maxima，XP_022999703.1）的SAMDC蛋白則聚為另一分支。利用DNAMAN對上述物種的SAMDC蛋白進行序列多重比較，結果發現均含有LSE-SSLF的酶原剪切位點結構域，以及與SAMDC蛋白降解相關的PEST結構域（TVHITPED-GFSYASYE），顯示出SAMDC蛋白功能結構域的高度保守特征。

2. 3 CrSAMDC基因表達分析結果

選取6年生沙糖橘果樹的嫩葉、老葉、花、30 d幼果果肉和30 d幼果果皮等5個組織樣品，提取其總RNA后反轉錄合成cDNA，以實時熒光定量PCR檢測CrSAMDC基因的組織表達特性。由圖5可知，CrSAMDC基因在沙糖橘的葉、花、果肉和果皮中均有表達，但以嫩葉的相對表達量最高，其次為花，而30 d幼果果肉的相對表達量僅為嫩葉的14.5%。說明CrSAMDC基因表達具有明顯的組織特異性，且在分裂旺盛的嫩葉和花器官中高表達。

為研究干旱脅迫下CrSAMDC基因的表達特性，采用10% PEG-6000對新發秋梢進行模擬干旱脅迫處理，分別于脅迫處理后0、3、6、9、12、24和36 h取樣進行檢測分析。由圖6可知，隨著干旱脅迫處理時間的延長，CrSAMDC基因的相對表達量呈先上升后下降的變化趨勢。以干旱脅迫后24 h的相對表達量最高，是對照處理的7.35倍。說明沙糖橘在干旱脅迫下可通過調節CrSAMDC基因高效表達，促進精胺和亞精胺等多胺合成，緩解干旱環境對植物生長發育的影響，以維持沙糖橘正常的生長發育。

2. 4 Southern雜交分析結果

為明確CrSAMDC基因在沙糖橘基因組中的拷貝數目，而進行Southern雜交分析，結果（圖7）顯示，采用探針上無酶切位點的EcoR I、BamH I和Sac I進行酶切，Southern雜交僅檢測到1條條帶;而采用含有1個酶切位點的Dra I進行酶切，Southern雜交檢測到2條條帶，說明CrSAMDC基因在沙糖橘基因組中可能以單拷貝形式存在。

2. 5 融合蛋白誘導表達情況

經EcoR I和Sac I雙酶切鑒定及測序分析，可確認pET32a-CrSAMDC為正確的重組質粒。對含有重組質粒pET32a-CrSAMDC的BL21（DE3）原核表達菌株進行IPTG誘導表達，然后利用超聲波破碎細胞并離心，分別收集上清液和沉淀，以12% SDS-PAGE進行電泳檢測，結果（圖8）顯示，在上清液中檢測到1條約61.0 kD的條帶，與預期的融合蛋白大小相符，而pET32a空載體在21.0 kD附近出現明顯的GST標簽蛋白條帶，說明CrSAMDC融合蛋白誘導表達成功，且主要以可溶性的形式存在。

3 討論

柑橘是熱帶亞熱帶地區多年生木本果樹。據統計，2017年全球柑橘收獲面積945.35萬ha，收獲產量14645.90萬t（張浩，2018）。我國柑橘種植面積258.72萬ha，柑橘產量3816.78萬t（田楠坤，2019）。我國柑橘主要種植在丘陵山地等露天旱地環境中，其生長周期長且受自然環境調控，易受干旱和低溫等氣候影響及病蟲害威脅（王靜，2009）。多胺是調控植物生長發育和緩解逆境脅迫的關鍵物質，而SAMDC作為多胺合成的關鍵限速酶，可能參與植物應對干旱及低溫等逆境脅迫的調控過程（Wi et al.，2014;劉長命等，2019）。王靜（2009）研究發現，枳在低溫脅迫下其SAMDC基因被誘導表達，且低溫脅迫時間越長，SAMDC基因表達量越高。王廣龍等（2017）在胡蘿卜中克隆獲得SAMDC基因，并證實其在高溫、低溫、干旱及鹽漬等逆境脅迫下高表達，在胡蘿卜抗逆境脅迫過程中發揮重要的調節作用。本研究從沙糖橘中克隆獲得CrSAMDC基因，其cDNA序列全長1736 bp，編碼376個氨基酸殘基，與擬南芥、胡蘿卜等雙子葉植物的SAMDC蛋白氨基酸殘基數目相近（王廣龍等，2017），與克里曼丁橘和甜橙的SAMDC蛋白親緣關系最近，其氨基酸序列同源性分別為99.5%和97.3%;CrSAMDC蛋白含有高度保守的酶原剪切位點LSE-SSLF及與SAMDC蛋白降解相關PEST結構域。實時熒光定量PCR檢測結果顯示，CrSAMDC基因在沙糖橘各組織中均有表達，但其表達量具有明顯的組織特異性，以在分裂旺盛的嫩葉和花器官中表達量較高，與SAMDC基因在馬鈴薯（Mad Arif et al.，1994）、胡蘿卜（王廣龍等，2017）、甘蔗（劉金仙等，2010）等作物中的表達分布相似。

在干旱脅迫下，植物可通過上調SAMDC基因表達水平，以提高體內多胺含量而增強抗氧化能力，進而提高植株的抗旱性（Wi et al.，2014;文樂等，2015）。本研究結果表明，干旱脅迫下CrSAMDC基因表達水平呈先上升后下降的變化趨勢，以干旱脅迫后24 h的表達量最高，即干旱脅迫會誘導CrSAMDC基因高水平表達，因此推測沙糖橘可能通過合成多胺來緩解干旱環境對植物生長發育的影響，說明CrSAMDC基因參與干旱脅迫響應的代謝調控過程。Southern雜交分析的結果表明，CrSAMDC基因在沙糖橘基因組中可能含有1個拷貝數，與紐荷爾臍橙（C. junos）的檢測結果（王靜，2009）基本一致。此外，本研究通過構建重組質粒pET32a-CrSAMDC，并通過BL21（DE3）原核表達菌株成功誘導表達獲得約61.0 kD的融合蛋白，為進一步探究SAMDC在調控抗旱脅迫等非生物逆境作用的分子機制及遺傳改良等提供了理論基礎。

4 結論

CrSAMDC基因在沙糖橘中的表達具有組織特異性，且以單拷貝存在，在干旱脅迫下呈上調表達趨勢，即參與干旱脅迫響應的多胺代謝調控。

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（責任編輯 蘭宗寶）