植物源殺蟲劑苦參堿對羅非魚三代蟲的殺滅效果

鐘全福

摘要：【目的】明確苦參堿對羅非魚三代蟲的殺滅效果，并分析藥物濃度、作用時間及苦參堿與敵百蟲配伍對羅非魚三代蟲的聯合毒力，為苦參堿在水產養殖中的推廣應用提供參考依據。【方法】以浸浴試驗測定2.0%苦參堿和90%敵百蟲對羅非魚三代蟲的毒力，計算半數致死濃度（LC50）;在此基礎上采用交互測定法進行苦參堿與敵百蟲配比篩選，通過毒效比和共毒系數（CTC）測定苦參堿與敵百蟲配伍對羅非魚三代蟲的聯合毒力，并利用安全濃度（SC）和藥物毒性蓄積程度系數（MAC）評價苦參堿—敵百蟲復合制劑對羅非魚苗種的安全性。【結果】2.0%苦參堿對羅非魚三代蟲有較強的殺滅能力，對應的24、48、72 h的LC50分別為1.305、0.843和0.562 mg/L;2.0%苦參堿與90%敵百蟲按質量比7∶5配伍時毒效比最高（1.54），其對羅非魚三代蟲24、48、72 h的LC50分別為0.433、0.353和0.232 mg/L，對應的CTC分別為294.12、207.02和206.22。苦參堿—敵百蟲復合制劑（質量比7∶5）對羅非魚苗種24、48、72 和96 h的LC50分別為28.410、24.494、19.982和17.265 mg/L，SC為1.727 mg/L;MAC在24～72 h期間隨浸浴時間的延長而升高，且在48～72 h期間出現最大值（40.485%），在72～96 h期間下降較明顯，但均大于0，即苦參堿—敵百蟲復合制劑（質量比7∶5）屬于低毒級藥物制劑。【結論】植物源殺蟲劑苦參堿對魚類三代蟲有良好的殺蟲活性及較低的魚類毒性，尤其與敵百蟲配伍表現出明顯的協同增效作用，既提高藥效，又降低驅蟲藥物的使用劑量和用藥成本，且能克服單劑藥物易產生抗藥性的問題，可在水產養殖生產上推廣應用。

關鍵詞： 苦參堿;三代蟲;羅非魚;殺蟲效果;共毒系數（CTC）;藥物毒性蓄積程度系數（MAC）

Abstract：【Objective】The antiscolic effect of matrine against Gyrodactylus of tilapia was definited， and the drug concentration， action time and combined toxicity of matrine and trichlorfon to Gyrodactylus of tilapia were analyzed， so as to provide reference for the promotion and application of matrine in aquaculture. 【Method】The virulence of 2.0% matrine and 90% dipterex to Gyrodactylus of tilapia was determined by immersion bath test， and the median lethal concentration （LC50） was calculated. On this basis， the synergistic ratio of matrine and dipterex was screened by interactive assay， and the joint virulence of matrine and dipterex against Gyrodactylus of tilapia was determined by effect ratio and co-toxicity coefficient（CTC）， and the safe concentration（SC） and the toxicity accumulation coefficient（MAC） were used to evalua-te the safety of matrine-dipterex compound against tilapia fry. 【Result】The results showed that，2.0% matrine had high antiscolic effect on Gyrodactylus of tilapia， the LC50 of 2.0% matrine on 24， 48 and 72 h were 1.305， 0.843 and 0.562 mg/L， respectively. The toxicity-efficacy ratio was the highest（1.54）， when the mass ratio of 2.0% matrine and 90% dipterex was 7∶5， and the LC50 of the mixed formulation on Gyrodactylus of tilapia at 24， 48 and 72 h were 0.433， 0.353 and 0.232 mg/L， at the same time， the corresponding CTC were 294.12， 207.02 and 206.22. The LC50 of the matrine-dipterex compound on juvenile tilapia at 24， 48， 72 and 96 h were 28.410， 24.494， 19.982 and 17.265 mg/L respectively， and the SC was 1.727 mg/L. MAC increased with the prolongation of immersion time from 24 to 72 h， and reached the maximum va-lue （40.485%） during 48-72 h， and decreased greatly during 72-96 h， but both were greater than 0. That was， the matrine-dipterex compound（mass ratio 7∶5） belonged to low toxic substances. 【Conclusion】The botanical pesticide matrine has high insecticidal efficacy and low toxicity to Gyrodactylus of fish， especially it shows a synergistic effect between matrine and dipterex to control Gyrodactylus. It can not only improve the efficacy， but also reduce the dosage and cost of anthelmintic agent， and overcome the problem of single drug resistance. Therefore， matrine can be widely used in aquaculture.

Key words： matrine; Gyrodactylus; tilapia; antiscolic effect; co-toxicity index（CTC）; toxicity accumulation coe-fficient（MAC）

0 引言

【研究意義】三代蟲（Gyrodactylus spp.）隸屬于單殖吸蟲綱（Monogenoidea）三代蟲目（Gyrodactyli-dea）三代蟲科（Gyrodactylidae）三代蟲屬（Gyrodactylus），是水產養殖動物的常見體表寄生蟲，為我國三類水生動物疫病病原（李冉冉等，2014;陳濤，2018）。三代蟲雌雄同體，具有超胎生和幼體繁殖的特性，超強的繁衍性能促使其種群增長和傳播速度快，對宿主特別是稚幼魚的危害極大（周曉楊和張其中，2004;陳愛平等，2011）。在水產養殖動物三代蟲病的防治過程中，常采用敵百蟲、高錳酸鉀、甲醛、甲苯咪唑、辛硫磷及氯氰菊酯等菊酯類殺蟲劑進行浸泡處理（任景坤等，2006;張超睿等，2008），但長期及超量使用會導致三代蟲耐藥性增強，防治效果不理想（周順等，2016）。因此，開發高效、安全的植物源性殺蟲劑替代藥物成為防治水產養殖動物三代蟲病的當務之急。【前人研究進展】至今，已有學者開展了一系列針對三代蟲防治藥物篩選的相關研究。劉灃津等（1991）對虹鱒三代蟲病的藥物篩選試驗結果表明，潑灑法以0.35 mg/L敵百蟲+25 mg/L石灰水的殺蟲效果較優，藥浴法則以0.4%食鹽水溶液的殺蟲效果最佳;王昭明等（1997）對鮭科魚細鱗魚三代蟲病的防治試驗結果表明，1/2000的福爾馬林全池藥浴15 min對體表三代蟲的殺滅率可達100%;林崗等（2004）研究表明，丙硫咪唑對秀麗三代蟲有較強的殺滅能力，24 h的有效濃度為1 mg/L，36 h的殺滅濃度為2 mg/L;林學明（2005）研究證實，AEZ滅蟲王能有效殺滅對傳統殺蟲劑產生強抗藥性的金魚三代蟲;周順等（2016）研究表明，次氯酸鈉溶液和二氧化氯對小林三代蟲均有較好的殺滅效果，但100%的殺滅濃度略高于其對金魚的安全濃度。在中藥防治方面，Tu等（2013）研究發現檀香氯仿提取物能有效殺滅金魚三代蟲和指環蟲;Fridman等（2014）研究證實7.5 mL/L大蒜水提取物能顯著減少孔雀魚體表上的三代蟲數量;Kj?rstad和Arnekleiv（2015）研究表明，魚藤酮對大西洋鮭魚三代蟲具有很好的殺蟲效果，但對宿主魚類高毒;Levy等（2015）研究證實生姜乙醇提取物也能顯著降低孔雀魚體表上的三代蟲寄生數量;Zhou等（2017）通過對比3種常用消毒劑和4種中藥提取物對金魚小林三代蟲的驅蟲效果，發現三氯異氰尿酸48 h的殺滅濃度為1 mg/L，博落回甲醇提取物48 h的50%有效濃度（EC50）、90%有效濃度（EC90）分別為8.6和25.5 mg/L;涂笑（2019）研究表明，4.00 mg/L牛蒡子苷元作用4 h對小林三代蟲的殺滅率可達100%。【本研究切入點】苦參堿是一種低毒、低殘留、環保型植物源殺蟲劑（楊婉莉等，2018），具有很好的殺滅寄生蟲生物學活性，且能與化學殺蟲藥劑復配，起到明顯的增效作用，進而極大降低傳統殺蟲劑使用劑量，防止蟲體抗藥性產生，并降低殺蟲藥物對環境的污染（吳波等，2019），但至今鮮見將苦參堿應用于水產養殖動物三代蟲防治的研究報道。【擬解決的關鍵問題】探究苦參堿對羅非魚三代蟲的殺滅效果，并分析藥物濃度、作用時間及苦參堿與敵百蟲配伍對羅非魚三代蟲的聯合毒力，以期為苦參堿在水產養殖中的推廣應用提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

苦參堿購自天津市恒源偉業生物科技發展有限公司，有效含量2.0%;敵百蟲購自湖北沙隆達股份有限公司，含量90%;二甲基亞砜（DMSO）購自天津恒興化學試劑制造有限公司，含量99%。苦參堿和敵百蟲分別以DMSO為溶劑，配制成10 g/L母液;苦參堿—敵百蟲復合制劑是由2.0%苦參堿和90%敵百蟲按質量配比后，以DMSO溶解配制成10 g/L母液。患三代蟲病的羅非魚苗種由福建省淡水水產研究所榕橋試驗基地提供，其體長3～5 cm，抽樣檢查的羅非魚體表寄生有三代蟲。供試羅非魚暫養于實驗室內直徑1.6 m的玻璃鋼纖維養殖桶中，連續充氣增氧，每天換水1次，換水量為30%左右;暫養2～3 d后檢查，羅非魚體表蟲體數量未減少，即可用于后續的藥物殺蟲試驗。

1. 2 苦參堿和敵百蟲對羅非魚三代蟲的毒力測定

試驗在0.4 m×0.8 m×0.4 m的水簇箱中進行，每個水簇箱裝100 L溪水。試驗設0.32、0.42、0.56、0.75、1.00和2.00 mg/L的2.0%苦參堿處理組及0.21、0.32、0.49、0.75、1.15和1.80 mg/L的90%敵百蟲處理組，隨機選取感染三代蟲的羅非魚，每個試驗水簇箱投放20尾，每個處理組設3個平行，同時設空白對照組。試驗期間不間斷充氣增氧，水溫控制在26～27 ℃，浸浴72 h，觀察羅非魚的活動情況。按照林崗等（2004）、周順等（2016）的方法，分別于浸浴24、48和72 h時每個處理組隨機采樣3尾羅非魚，以MS-222麻醉后在體視鏡下逐尾檢查其體表三代蟲數量，統計殺蟲率，并計算半數致死濃度（LC50）。

1. 3 苦參堿與敵百蟲配伍對羅非魚三代蟲的聯合毒力

1. 3. 1 苦參堿與敵百蟲配比篩選 以單劑2.0%苦參堿、90%敵百蟲的72 h-LC50為基礎，采用交互測定法進行配比篩選（謝婷等，2019），設7個濃度梯度及空白對照，共8個處理組，各處理組的苦參堿和敵百蟲比例如表1（以各自LC50為100%，按照各自比例分別計算其對應的含量）所示。試驗方法同1.2，浸浴72 h后統計殺蟲率，并計算苦參堿與敵百蟲的毒效比。其計算公式如下：

預期殺蟲率=A農藥LC50實際殺蟲率×A農藥所占比例+B農藥LC50實際殺蟲率×B農藥所占比例

毒效比=實際殺蟲率/預期殺蟲率

評判標準：毒效比>1.25為增效作用，毒效比<0.75為拮抗作用，0.75≤毒效比≤1.25為相加作用（董文陽等，2019）。

1. 3. 2 苦參堿與敵百蟲增效組合的共毒系數測定

選擇毒效比大于1.25的增效組合配比，測定苦參堿—敵百蟲復合制劑對羅非魚三代蟲的聯合驅殺作用，試驗方法同1.2，統計殺蟲率，并計算苦參堿—敵百蟲復合制劑的LC50及共毒系數（CTC）。以敵百蟲為標準藥劑，通過CTC評判聯合藥物的毒力，評判標準為：CTC<80為拮抗作用，80≤CTC<120為相加作用，120≤CTC<200為增效作用，CTC≥200為顯著增效作用。其計算公式如下：

實際毒力指數（ATI）=標準藥劑的LC50/混合藥劑的LC50×100

毒力指數（TI）=標準藥劑的LC50/供試藥劑的LC50×100

理論毒力指數（TTI）=∑（供試藥劑的TI×該藥劑在混合藥劑中的比例）CTC=ATI/TTI×100

1. 4 苦參堿—敵百蟲復合制劑對羅非魚苗種的急性毒性效應與安全評價

參照GB/T 31270.12—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則 第12部：魚類急性毒性試驗》，采用靜態試驗法測定苦參堿—敵百蟲復合制劑對羅非魚苗種的急性毒性效應。在預試驗的基礎上，按等對數間距設6個濃度梯度，分別為12.5、16.0、20.1、25.0、31.5和40.0 mg/L，每個濃度設3個平行和空白對照組，每個試驗組15尾羅非魚。試驗期間不間斷充氣增氧，水溫控制在26～27 ℃，浸浴96 h，觀察并記錄浸浴24、48、72和96 h時的羅非魚死亡數，統計死亡率，計算其LC50和安全濃度（Safe concentrations，SC），并利用藥物毒性蓄積程度系數（Accumulation coefficient，MAC）分析羅非魚體內苦參堿—敵百蟲復合制劑的蓄積及降減變化（羅鳴鐘等，2018），相關計算公式如下：

SC（mg/L）=96 h-LC50×0.1MAC（%）=（某觀察時段的半數致死濃度差/最初觀察點與試驗結束時的半數致死濃度差）×100

1. 5 統計分析

試驗數據均采用Excel 2007和SPSS 17.0進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 苦參堿和敵百蟲對羅非魚三代蟲的毒力

由表2可知，苦參堿對羅非魚三代蟲有較強的殺滅能力，對羅非魚三代蟲的24、48、72 h的LC50分別為1.305、0.843和0.562 mg/L。由表3可知，敵百蟲對羅非魚三代蟲的24、48、72 h的LC50分別為1.232、0.616和0.396 mg/L，對羅非魚三代蟲72 h的殺滅濃度為1.80 mg/L，遠高于《新編漁藥手冊》（2005年版）推薦的敵百蟲常規使用最高劑量（0.2～0.5 mg/L），即羅非魚三代蟲對敵百蟲存在明顯的抗藥性。

2. 2 苦參堿與敵百蟲配比的篩選結果

以苦參堿和敵百蟲對羅非魚三代蟲的72 h-LC50為100%，采用交互測定法進行不同配比（M∶D）的篩選，處理設計及試驗結果詳見表4。由表4可知，在苦參堿與敵百蟲不同配比中，對羅非魚三代蟲殺滅效果優于各單劑的處理組有60%∶40%、50%∶50%和40%∶60%，且實際殺蟲率高于預期殺蟲率。其中，以50%∶50%處理組的毒效比最高，為1.54，表現出較明顯的增效作用;60%∶40%和40%∶60%處理組的毒效比分別為1.23和1.24，增效作用較弱。

2. 3 苦參堿與敵百蟲配伍對羅非魚三代蟲的聯合毒力

選擇苦參堿與敵百蟲配伍具有明顯增效作用的配比（0.28 mg/L 2.0%苦參堿+0.20 mg/L 90%敵百蟲，即質量比7∶5）進行復合制劑的聯合毒力測試，并計算CTC，以明確苦參堿—敵百蟲復合制劑對羅非魚三代蟲的聯合毒力。由表5可知，苦參堿—敵百蟲復合制劑對羅非魚三代蟲的24、48、72 h的LC50分別為0.433、0.353和0.232 mg/L，對應的CTC分別為294.12、207.02和206.22，均大于120，表明苦參堿與敵百蟲按質量比7∶5配伍對羅非魚三代蟲有明顯的增效作用，且殺蟲效果與作用時間和藥物濃度成正比。苦參堿—敵百蟲復合制劑對羅非魚三代蟲48 h的殺滅濃度為0.63 mg/L，72 h的殺滅濃度為0.50 mg/L，且在殺蟲率達100.00%的72 h最高試驗濃度下（0.63 mg/L）羅非魚苗種均未出現死亡。

2. 4 苦參堿—敵百蟲復合制劑對羅非魚苗種的急性毒性效應

由表6可知，苦參堿—敵百蟲復合制劑對羅非魚苗種的LC50隨浸泡時間的延長而下降，其24、48、72、96 h的LC50分別為28.410、24.494、19.982和17.265 mg/L，SC為1.727 mg/L。羅非魚苗種對苦參堿—敵百蟲復合制劑的MAC在24～72 h期間隨浸浴時間的延長而升高，且在48～72 h期間出現最大值（40.485%），在72～96 h期間下降較明顯，但均大于0。

3 討論

苦參堿類植物源殺蟲劑具有選擇性強、低毒、低殘留及廣譜殺蟲抗菌活性的特點，對寄生蟲中樞神經系統產生麻痹作用或毒殺作用，且具有獨特的作用位點和方式，不易與其他殺蟲劑產生交叉耐藥性，也不易誘導寄生蟲產生抗藥性，可長期使用，在農業生產上已得到廣泛應用（蔡偉，2012）。近年來，應用植物源殺蟲劑防治寄生性魚病的研究已取得一定進展，如0.1 g/L的檳榔和烏梅水提物對各階段小瓜蟲均有殺滅效果，1.0 g/L的大黃和黃芩水提物則能殺滅小瓜蟲成蟲和包囊（鉏超等，2010）;10 mg/L的苦參提取物對草魚車輪蟲24 h的殺蟲率達100%（田海軍和劉彥鵬，2011）;100 mg/L的黃花煙草提取物對金魚鰓上指環蟲48 h的殺蟲率達90%（王高學等，2011）;200、40和100 mg/L的肉桂、烏藥、土荊皮提取物對金魚指環蟲的殺蟲率達100%（暨杰，2013）;8 mg/L的黃柏、茯苓等復方中藥藥液對錦鯉鰓上指環蟲24 h的殺蟲率達100%（田海軍等，2013）;但有關中藥類殺蟲劑對魚類三代蟲病的研究與應用鮮見報道。本研究通過對羅非魚三代蟲進行藥物浸浴試驗，結果表明苦參堿浸浴能有效殺滅羅非魚體表上的三代蟲，進一步佐證苦參堿防治魚類三代蟲病的可能性。

至今，關于植物源殺蟲劑苦參堿與其他活性成分殺蟲劑聯用的研究已有較多報道。苦參堿與阿維菌素按質量比24∶1復配具有明顯的增效作用，對菜青蟲和朱砂葉螨的TI分別為苦參堿單劑的47和210倍，且CTC均大于150（葛紅等，2006）;苦參堿與多殺霉素復配防治草莓薊馬增效作用明顯，按1∶2比例混配時CTC達145.51（吉沐祥等，2013）;苦參堿與印楝素復配的增效作用明顯提高，對防治赤擬谷盜和玉米象的最佳殺蟲配比為3∶2，96 h的CTC達154.85（周劍暉，2015）。本研究以苦參堿與敵百蟲配伍，在測定苦參堿和敵百蟲單劑對羅非魚三代蟲的毒力基礎上，探究苦參堿與敵百蟲復配對羅非魚三代蟲的聯合毒力，結果表明，苦參堿與敵百蟲對防治羅非魚三代蟲具有協同促進作用，2.0%苦參堿與90%敵百蟲按質量比7∶5配伍時，其毒效比為1.54，CTC均大于200，增效作用顯著。說明植物源殺蟲劑苦參堿與有機磷殺蟲劑敵百蟲配伍使用可有效提高殺蟲效果，從而減少有機磷殺蟲劑的使用劑量，降低寄生蟲抗藥性，對防治水產病蟲害及保護水域環境具有重要意義。

根據GB/T 31270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》發布的毒性分級標準：96 h-LC50≤0.1 mg/L為劇毒，0.1 mg/L<96 h-LC50≤1.0 mg/L為高毒，1.0 mg/L<96 h-LC50≤10.0 mg/L為中毒，96 h-LC50>10.0 mg/L為低毒。本研究結果表明，苦參堿—敵百蟲復合制劑（質量比7∶5）對羅非魚苗種的96 h-LC50為17.265 mg/L，屬于低毒級藥物制劑。在不考慮藥物制劑在水體中的自然降解時，生物體對藥物制劑的蓄積與降減動態主要采用MAC來表示（王志錚等，2007），MAC越大，說明毒效蓄積幅度越大，生物體抗毒能力下降，MAC>0時，即蓄積作用強度大于降減作用。本研究通過分析羅非魚苗種對苦參堿—敵百蟲復合制劑（質量比7∶5）的MAC，發現其在48～72 h期間達最大值（40.485%），表明在72 h的時間段內藥物毒性在羅非魚苗種體內的蓄積作用較強，蓄積強度遠大于降減作用;在72～96 h期間則明顯下降，MAC僅為48～72 h最高點的60.22%，是24～48 h的69.38%，說明此時羅非魚苗種對苦參堿—敵百蟲復合制劑（質量比7∶5）的毒效降解能力較強，藥物毒性的蓄積速度下降。因此，在探討藥物毒性效應及分析藥物毒性蓄積變化時，還應充分考慮藥物自然降解程度及時效的多重影響。

4 結論

植物源殺蟲劑苦參堿對魚類三代蟲有良好的殺蟲活性及較低的魚類毒性，尤其與敵百蟲配伍表現出明顯的協同增效作用，既提高藥效，又降低驅蟲藥物的使用劑量和用藥成本，且能克服單劑藥物易產生抗藥性的問題，可在水產養殖生產上推廣應用。

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（責任編輯 蘭宗寶）