玉米高密度SNP遺傳圖譜構建及其禿尖QTL定位

覃嘉明 王兵偉 鄭加興 覃永嬡 黃安霞 何靜丹 韋紹麗 時成俏

摘要：【目的】構建在禿尖性狀上存在明顯差異的玉米高密度SNP遺傳圖譜，并對其禿尖QTL進行定位，為玉米禿尖分子機理研究及玉米抗禿尖品種選育提供理論參考。【方法】以無禿尖性狀的自交系S群411331為母本、有禿尖性狀的自交系綜53313為父本，通過雜交和自交獲得F2代群體。利用容量達10K的分子芯片獲取大量SNP分子標記，從中篩選出具有多態性的SNP分子標記，構建F2代群體的高密度遺傳圖譜，并結合禿尖表型數據，分別采用QTL定位軟件Rqtl和QTL.gCIMapping.GUI 1.1對相應的禿尖QTL位點進行鑒定及定位。【結果】F2代群體的平均禿尖長度為4.25 cm，說明其禿尖性狀更偏向于父本綜53313，禿尖整體較長，且禿尖變幅為0～6.1 cm，偏度和峰度值均位于-1.00～1.00，符合數量性狀的分布特征。從2612個多態SNP分子標記中共篩選出2599個SNP分子標記成功構建遺傳連鎖圖譜，總圖距5624.38 cM，標記間平均距離2.27 cM。利用Rqtl共檢測到6個QTL，分別位于第3、4、5、6、8和9染色體，其中加性效應和顯性效應最大的2個QTL分別位于第6和8染色體，解釋遺傳變異的14.4%和16.3%。利用QTL.gCIMapping.GUI 1.1共檢測到9個QTL，分別位于第1、4、5、6、8和9染色體，顯性效應和加性效應最大的2個QTL分別位于第6和8染色體，與Rqtl檢測結果相比，二者均在第8和9染色體的同一位置檢測到1個QTL，在第5染色體檢測到的QTL位置也較鄰近，且效應最大的2個QTL均位于第6和8染色體;不同之處在于Rqtl在各染色體上只檢測到1個QTL，而QTL.gCIMapping.GUI 1.1在第6和8染色體分別檢測到2和3個QTL，在第1染色體檢測到1個QTL，在第3染色體未檢測到QTL，而Rqtl檢測出的第1和3染色體QTL情況相反。【結論】玉米禿尖QTL分別位于第1、3、4、5、6、8和9染色體，其中主效QTL在第6和8染色體。

關鍵詞： 玉米;禿尖;SNP;遺傳圖譜;QTL定位

Abstract：【Objective】QTL mapping for ear tip barrenness was made by constructing a genetic map with two maize inbred lines which had great difference on ear tip barrenness character，which would provide information at molecular level for mechanism research of ear tip barrenness and maize breeding with anti ear tip barrenness. 【Method】With maize inbred line Squn 411331 as female parent， Zong 53313 as male parent， a F2 population was obtained by crossing and selfing. A high-density SNP genetic map was constructed by SNP molecular markers with polymorphism which were screened out from a cloud of SNP markers originated from 10K molecular chips. By using the QTL mapping softwares of Rqtl and QTL.gCIMapping.GUI 1.1 and combining phenotypic identification，QTL mapping of ear tip barrenness was conducted. 【Result】The average length of ear tip barrenness of F2 population was 4.25 cm， which meaned that the characteristic of ear tip barrenness was more biased to the male parent Zong 53313. On the whole，the F2 population had longer ear tip barrenness with range of 0-6.1 cm. Both of the skew and kurtosis were located within -1.00 and 1.00，which fitted the distribution feature of quantitative trait. A genetic map of 2599 SNP molecular markers screened out from 2612 SNP molecular markers was constructed，which had total map distance of 5624.38 cM and average interval distance of 2.27 cM. By using Rqtl，six QTLs were located in chromosomes 3，4，5，6，8 and 9 respectively，among all the QTLs， two QTLs with the largest additive effect and dominant effect in chromosomes 6 and 8 could explain 14.4% and 16.3% of phenotypic variation respectively. While by using QTL.gCIMapping， nine QTLs were located in chromosomes 1，4，5，6，8 and 9 respectively，and the two? QTLs with the largest dominant effect and additive effect were in chromosome 6 and 8. Compared with Rqtl test， there were one QTL in chromosomes 8 and 9 being detected at the same position by Rqtl，? and the QTL in chromosome 5 were located nearby， and the two QTLs with the largest effect were both in chromosomes 6 and 8.? The difference between the two software was that Rqtl could only detected one QTL in chromosomes， but QTL.gCIMapping.GUI 1.1 could detect two and three QTLs in chromosomes 6 and 8 respectively. In the mean time，? one QTL was detected by QTL.gCIMapping.GUI 1.1 in chromosome 1， but none in chromosome 3， while a QTL was detected by Rqtl in chromosome 3， but none in chromosome 1. 【Conclusion】The QTLs for ear tip barrenness are located in chromosomes 1，3，4，5，6，8 and 9，among which，the major QTLs are in chromosomes 6 and 8.

Key words： maize; ear tip barrenness; SNP; genetic map; QTL mapping

0 引言

【研究意義】玉米是一種重要的糧食和動物飼料作物，也是一種生物質能源材料（Li et al.，2017;張鵬等，2019），提高其籽粒產量是玉米育種的首要任務，但產量相關性狀是復雜的數量性狀，受多基因控制。因此，從分子水平上對產量相關性狀進行研究有望快速提高玉米單產。自20世紀80年代利用分子標記構建遺傳圖譜（Botstein et al.，1980）以來，已定位發掘出大量玉米產量相關性狀的QTL（Messmer et al.，2009;Huo et al.，2016;Su et al.，2017;Choi et al.，2019;王賽等，2019）。禿尖是一種重要的玉米產量相關性狀，當前結實好、不禿尖的玉米種質很缺乏，而解決該問題的主要措施是選育出抗禿尖的種質材料，尤其是利用QTL定位方法發掘出優良的抗禿尖基因用于改良禿尖長的玉米自交系實為一種兼顧基礎研究和生產應用的好方法，對選育高產優質的玉米品種具有重要意義。【前人研究進展】唐祈林等（1999）對玉米不同雜交后代禿尖與小花數、退化花數和未受精花數的相關性進行研究，結果發現退化花和未受精小花是導致禿尖最直接的原因。李文才等（2008）用ADM模型對禿尖和非禿尖完全雙列雜交組合進行分析，結果發現玉米禿尖性狀主要受遺傳控制，狹義遺傳率為0.6328，同時禿尖長度與穗長、穗粗、穗行數、行粒數和軸粗呈顯著正相關。與穗長、穗粗等果穗性狀的研究相比，玉米禿尖QTL方面的研究報道較少。向道權等（2001）、孟昭東等（2008）、孫海艷等（2012）通過遺傳分析試驗發現，玉米果穗禿尖主要受2對主效基因控制，且以加性和顯性效應為主。張建華等（2009）在高種植密度（13.5萬株/ha）處理下從79個玉米DH系群體的第8和9染色體上各定位到1個禿尖QTL，但在低種植密度（6萬株/ha）處理下未檢測到禿尖QTL。才源等（2014）通過玉米6個世代的聯合分析及SSR分子標記檢測，將控制玉米果穗禿尖性狀的2個主效QTL定位在玉米的第2和7染色體上，二者符合加性—顯性—上位性的遺傳模型。Ding等（2016）研究發現，225株玉米F2∶3群體在不同的種植環境下均可檢測到3個玉米禿尖QTL，能解釋表型變異的16.6%。迄今為止，已成功克隆獲得一個與玉米禿尖性狀類似的果穗發育不良性狀基因BAF1（Gallavotti et al.，2011）;且對由單基因控制的玉米果穗發育不良突變系bif173和bif3進行精細定位，結果發現其控制基因定位于第2和8染色體1.2 M和0.05 M區間內（Amy，2013）。【本研究切入點】前人對玉米禿尖的定位研究常以傳統的SSR分子標記進行遺傳圖譜構建（Ding et al.，2016），但其易受分子標記數量的限制，致使構建的遺傳圖譜密度較低，從而無法與定位的QTL緊密連鎖，最終導致QTL定位區間太大。本研究應用高密度的SNP分子標記構建遺傳圖譜，能有效地縮小QTL定位區間并檢測到更多的QTL，目前鮮見其相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】以無禿尖性狀的自交系S群411331為母本、有禿尖性狀的自交系綜53313為父本，通過雜交和自交獲得F2代群體。利用容量達10K的分子芯片獲取大量SNP分子標記，從中篩選出具有多態性的SNP分子標記，構建F2代群體的高密度遺傳圖譜，并結合禿尖表型數據，分別采用QTL定位軟件Rqtl和QTL.gCIMapping.GUI 1.1對相應的禿尖QTL位點進行鑒定及定位，為玉米禿尖分子機理研究及抗禿尖品種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

選用自交系S群411331與自交系綜53313為親本材料。二者在禿尖性狀上存在明顯差異，S群411331果穗較小，但結實性好，無禿尖，即使在高溫、干旱等逆境下仍保持滿頂;綜53313則有明顯的禿尖性狀，即使在很低密度、良好肥水條件下仍表現禿頂。2017年秋季以自交系S群411331為母本、自交系綜53313為父本雜交產生F1代，F1代種子種植后選5個單株自交獲得F2代種子，隨機選擇1整穗F2代種子播種獲得F2代群體，用于構建其遺傳圖譜。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 田間試驗及禿尖測量 2018年秋季在廣西農業科學院明陽基地種植兩個親本材料及其F1代種子和173株F2代群體。玉米種植方式為秧盤點種育苗，3葉期移植試驗田，行距0.7 m，株距1.0 m。肥水管理同一般大田。在抽雄前采集植株葉片，于-80 ℃冰箱保存備用。群體各單株均套袋，吐絲散粉后立即對各植株自交授粉1次，間隔1 d再補授粉1次（因部分果穗有新花絲出現）。蠟熟期收獲各株果穗后在室內測量禿尖長度。

1. 2. 2 遺傳圖譜構建 首先使用昂飛玉米10K育種芯片（Affymetrix Maize SNP 10K Gene Chip）對173株的F2代群體及兩個親本材料進行基因型多態性檢測，參照Yan等（2010）的方法處理基因型數據，并提取所有多態SNP分子標記數據。然后利用JoinMap 4.0對多態SNP分子標記進行排序，并計算連鎖圖距（張瑩瑩等，2019），具體步驟如下：（1）過濾掉原始數據中的非多態SNP分子標記，再對余下的多態SNP分子標記進行卡方檢驗，去掉嚴重偏分離（P<0.001）的SNP分子標記。同時，排除缺失值≥20%的SNP分子標記。（2）將堿基格式的SNP分子標記進行轉碼，即與母本堿基相同記為a，與父本堿基相同記為b，雜合型記為h，缺失記為-。（3）對轉碼后的數據按Loc文件格式導入JoinMap中，對SNP分子標記數據進行分群，連鎖參數設為標記間重組頻率<0.35或LOD<1.00，作圖采用極大似然（Maximum likelihood，ML）算法，作圖函數為Kosambi。（4）獲得的標記遺傳距離信息用R代碼包LinkageMap里的命令lmv.linkage.plot繪制成二維的遺傳圖譜。

1. 2. 3 QTL定位分析 分別采用QTL定位軟件Rqtl（復合區間作圖法，CIM）（Broman et al.，2003;Broman and Sen，2009）和QTL.gCIMapping.GUI 1.1（gCIM法）（Zhang et al.，2019）進行QTL定位。Rqtl的分析方法及參數設置如下：（1）首先去掉遺傳圖譜中位置相同的SNP分子標記，將禿尖性狀的數據按Rqtl文件格式輸入R 3.6.1中。（2）用命令scanone加em字段（Expectation-maximization atgorithm，期望極大算法）進行一維QTL掃描。（3）用命令cim進行一維QTL掃描，協變量標記數選擇3，滑窗寬度選20 cM。（4）用命令calc.genoprob加命令scanone（字段n.perm取3000次）進行表型數據3000次的模擬輸入計算獲得QTL的閾值為3.3（5%顯著水平）。（5）挑出（1）和（2）步驟中均超過3.3閾值的QTL用命令scantwo進行二維QTL掃描，閾值模擬計算進行500次。（6）把一、二維QTL掃描而得的所有QTL用命令makeqtl進行建模，用命令fitqtl獲得各QTL的位置、LOD、R2及加性效應值和顯性效應值，用命令refineqtl校正各QTL的位置，用命令lodint獲得各QTL定位區間標記，最后用命令PlotLodProfile繪制QTL圖。QTL.gCIMapping.GUI 1.1的分析方法及參數設置如下：同樣去掉遺傳圖譜中位置相同的SNP分子標記，將禿尖性狀數據按QTL.gCIMapping文件格式導入QTL.gCIMapping.GUI 1.1窗口界面中，參數設置：LOD為3.0，模型選隨機模型，全基因組掃描步移速度1 cM/次，似然函數選用約束最大似然法（Restricted maximum likelihood，REML），鄰域完全復合區間作圖法選true。

1. 3 統計分析

禿尖長度數據采用WPS 2019和SPSS 21.0進行整理計算。

2 結果與分析

2. 1 禿尖性狀測量結果

由表1可知，F2代群體的平均禿尖長度為4.25 cm，說明其禿尖性狀更偏向于父本綜53313，禿尖整體較長，且禿尖變幅為0～6.1 cm，偏度和峰度值均位于-1.00～1.00，符合數量性狀的分布特征，可用于QTL作圖。

2. 2 遺傳圖譜構建

由表2可知，從2612個多態SNP分子標記中共篩選出2599個SNP分子標記成功構建遺傳連鎖圖譜（圖1），總圖距5624.38 cM。其中，第1染色體的SNP分子標記數最多，為360個，圖距最長，為749.05 cM;第10染色體的SNP分子標記數最少，為97個，圖距最短，為323.41 cM。10條染色體的SNP標記間平均距離為1.42～3.33 cM，平均為2.27 cM。各染色體均有1個或多個無多態SNP分子標記的區隔，第4染色體的標記最大距離最大，為121.02 cM，第9染色體的標記間最大距離最小，為39.88 cM。

2. 3 QTL分析檢測結果

按QTL的閾值3.3統計，Rqtl共檢測到6個QTL（表3和圖2），分別位于第3、4、5、6、8和9染色體。其中，第8染色體的QTL LOD最高，為10.8，能解釋表型變異的16.3%，顯性效應最大;其次是第6染色體的QTL，LOD為8.8，能解釋表型變異的14.4%，加性效應最大，其余QTL的表型變異解釋率較小，差異也較小，為5.6%～7.7%。

按QTL的閾值3.3統計，QTL.gCIMapping.GUI 1.1共檢測到9個QTL（表4和圖3），分別位于第1、4、5、6、8和9染色體，加性效應和顯性效應最大的兩個QTL分別位于第8和6染色體上。與Rqtl檢測結果相比，二者均在第8和9染色體的同一位置檢測到1個QTL，在第5染色體檢測到的QTL位置也較鄰近，且效應最大的2個QTL均位于第6和8染色體;不同之處在于Rqtl在各染色體只檢測到1個QTL，而QTL.gCIMapping.GUI 1.1在第6和8染色體分別檢測到2和3個QTL，在第1染色體檢測到1個QTL，在第3染色體未檢測到QTL，而Rqtl檢測出的第1和3染色體QTL情況相反。

3 討論

與低密度遺傳圖譜相比，高密度遺傳圖譜更適合用于QTL定位，不僅能提高QTL的檢測效率，還能提供與關聯QTL連鎖更緊密的分子標記用于分子標記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）（Hori et al.，2003）。此外，與SNP分子標記相比，SSR分子標記的基因分型過程不能借助機器實現自動化，費時費力，成本也更高。而SNP分子標記借助于高通量分型儀器及自身在全基因組中的高密度分布，已在遺傳分析中得到廣泛應用（Pham et al.，2014;Tian et al.，2015）。Ding等（2016）利用180個SSR分子標記構建遺傳圖譜，標記間平均距離為11.0 cM，玉米禿尖主效QTL定位于第3染色體的bnlg1325標記和umc2369標記之間，物理距離為4.6 M。而本研究構建的遺傳圖譜中SNP分子標記間平均距離2.27 cM，第8染色體的主效QTL被定位在AX86253671標記和AX86253710標記之間，物理距離僅為0.9 M。

QTL定位準確度是對基因進行精細定位及克隆的基礎，群體類型、群體大小、標記密度、定位性狀和QTL檢測等因素均會影響QTL定位準確度。因此，在定位性狀、群體類型（受限于建群時間）和群體大小（受限于成本）已確定的情況下，利用不同的QTL定位方法對定位群體基因型和表型數據進行分析比較有利于全面、準確地進行QTL定位。Su等（2017）利用QTL作圖軟件WinQTLCartgrapher 2.5的CIM法和R軟件包GLMNET/R的最小絕對值收縮及選擇操作法（LASSO）對玉米產量相關性狀（穗長、穗粗等）進行QTL定位，CIM法檢測到28個QTL，LASSO法檢測到29個QTL，兩種方法均檢測到的QTL有16個。本研究采用CIM法進行QTL定位，包含一維掃描、二維掃描及建立模型后重新檢測QTL，共3個過程，但近3年的研究文獻中，部分文獻（Zhang et al.，2017a，2017b;Cui et al.，2018;Choi et al.，2019;Zhang et al.，2019）使用CIM法進行QTL定位時，僅對QTL進行一維掃描檢測。雖然CIM法通過使用假定QTL鄰近的標記作為協變量來提高對QTL檢測效率，但其在選擇協變量標記過程中存在的不確定性會導致QTL定位過擬合，從而使定位結果不準確（Broman and Sen，2009）。本研究如果只采用CIM法進行檢測，僅第3、6、8和9染色體的QTL能被檢測出。本研究還采用了另一種QTL定位方法即gCIM法，使用的軟件QTL.gCIMapping.GUI 1.1是一種新近開發出的QTL定位軟件，通過全基因組關聯分析（GWAS）的方式計算多基因遺傳變異，能有效降低QTL定位過程中的背景噪音，從而檢測出小效應的QTL，且將緊密連鎖的2個QTL區分出（Zhang et al.，2019）。Wen等（2018）利用水稻永久F2代群體的4個性狀（產量、分蘗數、每穗粒數和千粒重）對gCIM法（隨機模型）和CIM法的檢測功效進行比較，結果發現前者共檢測出104個QTL，后者僅有46個QTL，且gCIM法（隨機模型）在小效應QTL的檢測率較CIM法高26.83%。本研究利用gCIM法在第6染色體檢測到2個QTL，在第8染色體檢測得到3個QTL，盡管CIM法進行多重掃描，但僅能在第6和8染色體各檢測出1個大效應的QTL。今后應通過這兩個效應較大的QTL鄰近位置開發出新的SNP分子標記，用于分子標記輔助育種改良禿尖玉米自交系，有助于提高玉米的產量和外觀。

4 結論

玉米禿尖QTL定位于第1、3、4、5、6、8和9染色體，其中主效QTL在第6和8染色體。

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