miR-485-5p通過靶基因FLOT2調控甲狀腺癌細胞增殖、凋亡的分子機制

張磊 李國良 孟幫柱 劉東明 常宏 韓立坤

(內蒙古民族大學附屬醫院內分泌科，內蒙古 通遼 028000)

甲狀腺癌發病率及致死率極高且患者預后較差，嚴重影響患者生命安全及生活質量〔1〕。因而尋找治療及診斷甲狀腺癌的分子標志物對提高臨床診療效果均具有重要意義。微小RNA(miRNA)作為內源性非編碼小RNA分子，研究顯示miRNA可在胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤中扮演抑癌或癌基因角色，并可能作為診斷及判斷疾病進展的潛在分子標志物〔2〕。miR-485-5p在肝癌組織中表達下調，過表達miR-485-5p可通過調控EMMPRIN的表達進而抑制肝癌細胞增殖和轉移〔3〕。研究顯示miR-485-5p在乳腺癌組織中下調表達，miR-485-5p過表達可抑制乳腺癌細胞的遷移侵襲能力〔4〕。然而，miR-485-5p對甲狀腺癌細胞惡性生物學行為的影響研究尚未見報道。通過靶基因預測軟件得到脂筏標記蛋白(FLOT)2可能是miR-485-5p的靶基因，研究報道FLOT2在肝癌組織及細胞中上調表達并可促進肝癌細胞的增殖、遷移侵襲，同時乳腺癌組織及細胞中FLOT2表達上調且與乳腺癌患者的不良預后相關〔5，6〕。本研究通過證實FLOT2是否為miR-485-5p的靶基因，探究miR-485-5p靶向FLOT2對甲狀腺癌細胞增殖及凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 甲狀腺癌細胞株SW579、FTC-133、KAT-18與甲狀腺上皮細胞TEC均購自中國科學院細胞庫。miR-485-5p mimic、miR-485-5p抑制劑(anti-miR-485-5p)及其各自陰性對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；FLOT2 siRNA(si-FLOT2)及其陰性對照(si-NC)均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；DMEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素及鏈霉素均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000購自上海陽光生物科技有限公司；RNA提取及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)實驗所需試劑均購自美國Thermo Fisher公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自大連美侖生物技術有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液及其他蛋白免疫印跡實驗所需試劑均購自美國Sigma公司；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved-caspase)-3、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p27、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)單克隆抗體均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2細胞培養、轉染及分組 取出凍存甲狀腺癌細胞株SW579、FTC-133、KAT-18與甲狀腺上皮細胞TEC，放入37℃恒溫水浴鍋內，待細胞融化后加入含有10%胎牛血清DMEM培養基的細胞生長液，同時含有100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，置于37℃、體積分數5%CO2培養箱培養，待細胞生長融合至80%左右時傳代培養。取對數生長期甲狀腺癌SW579細胞，胰蛋白酶消化細胞，以5×103個細胞/ml接種于6孔板，37℃、體積分數5% CO2培養箱培養，待細胞生長融合至80%時更換為不含胎牛血清的DMEM培養基，參照Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書分別將miR-485-5p mimic與miR-NC加入到SW579細胞，分別為miR-485-5p組、miR-NC組。為了探究FLOT2對SW579細胞生物學行為的影響，本研究分別將si-FLOT2與si-NC轉染到SW579細胞，分別為si-FLOT2組、si-NC組。后續實驗中為驗證miR-485-5p是否通過抑制FLOT2表達而影響SW579細胞增殖及凋亡，分別將FLOT2過表達載體(pcDNA-FLOT2)與空載體(pcDNA)分別與miR-485-5p mimic共同轉染入SW579細胞，分別為miR-485-5p+pcDNA組、miR-485-5p+pcDNA-FLOT2組。上述各組轉染6 h后更換為完全DMEM培養基。繼續培養48 h收集細胞。

1.3qRT-PCR檢測細胞中miR-485-5p及FLOT2 mRNA表達水平 取不同甲狀腺癌細胞、正常甲狀腺上皮細胞及轉染各組對數生長期SW579細胞，RNA提取：分別加入Trizol裂解細胞提取細胞總RNA，置于冰上5 min，分別加入氯仿(200 μl)，室溫放置5 min后12 000 r/min離心15 min，吸取水相層置于另一EP試管內，加入500 μl異丙醇，室溫放置20 min后12 000 r/min離心15 min，棄上清，加入乙醇混合(75%)后12 000 r/min離心5 min，棄上清，所有操作需在通風櫥內進行，最后將EP試管置于超凈工作臺晾干，加入適量無RNA酶水，利用紫外分光光度計檢測RNA濃度與純度，置于-80℃超低溫冰箱保存待測。反轉錄：按照反轉錄試劑盒說明書配置反應體系并進行普通PCR擴增得到cDNA。qRT-PCR：根據試劑盒說明書配置反應體系，完成后置于實時熒光定量PCR儀檢測各基因Ct值，反應條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環40次。miR-485-5p以U6為內參基因，FLOT2以GAPDH為內參基因，反應結束后，采用 2-ΔΔCt法計算miR-485-5p及FLOT2 mRNA相對表達量。

1.4Western印跡檢測FLOT2、CyclinD1、p21、p27、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達 取1.2中所有分組細胞，分別加入蛋白裂解液提取蛋白，經二喹啉甲酸(BCA)定量蛋白后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳反應，轉膜、封閉后分別加入各蛋白一抗(1∶500)，洗膜后加入二抗(1∶1 000)，TBST洗膜，ECL顯影后置于凝膠成像系統及Quantityone軟件檢測條帶灰度值，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參照條帶灰度值。

1.5MTT檢測細胞增殖 收集轉染后各組SW579細胞，胰蛋白酶消化后制備細胞懸浮液，以每孔100 μl體積細胞懸浮液接種于96孔板(濃度3×105個/ml)，分別于培養12、48、72 h時加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液50 μl，室溫孵育4 h，棄上清，分別加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μl，放入搖床內10 min，置于酶標儀檢測各孔吸光度(OD)，檢測波長為490 nm，每組實驗均設置3次重復。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組對數生長期SW579細胞，預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，采用胰蛋白酶消化細胞，10 000 r/min離心5 min，分別加入PBS洗滌細胞，加入1 ml結合緩沖液，再次離心后棄上清，分別加入200 μl結合緩沖液，再次分別加入5 μl膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)與碘化丙錠(PI)，室溫避光孵育20 min，分別加入400 μl結合緩沖液置于流式細胞儀檢測并計算細胞凋亡率。

1.7熒光素酶報告基因檢測 靶基因預測庫預測miR-485-5p與FLOT2的3′UTR存在結合位點，將含有miR-485-5p結合位點的FLOT2的3′UTR片段插入PGL3熒光素酶報告基因載體，分別構建野生型(WT-FLOT2)與突變型(MUT-FLOT2)的FLOT2 3′UTR熒光素酶報告載體，將WT-FLOT2、MUT-FLOT2分別與miR-485-5p mimic、miR-NC共轉染，培養箱內派樣48 h后收集細胞，嚴格按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作并檢測各組SW579細胞的熒光素酶活性。

1.8統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-485-5p和FLOT2在甲狀腺癌細胞和甲狀腺上皮細胞中的表達 甲狀腺癌細胞SW579、FTC-133、KAT-18中的miR-485-5p相對表達量與甲狀腺上皮細胞TEC差異有統計學意義(P<0.05)，3種甲狀腺癌細胞中SW579細胞相對表達量最低；而FLOT2 mRNA及蛋白表達顯著升高(P<0.05)，3種甲狀腺癌細胞中SW579細胞表達水平最高，選擇SW579細胞作為后續研究。見圖1、表1。

表1 miR-485-5p和FLOT2在甲狀腺癌細胞和甲狀腺上皮細胞中的表達

圖1 FLOT2蛋白表達

2.2miR-485-5p過表達對甲狀腺癌SW579細胞增殖的影響 qRT-PCR檢測結果顯示轉染后miR-485-5p組SW579細胞中miR-485-5p相對表達量明顯升高(P<0.05)，提示轉染成功。MTT檢測結果顯示轉染后12 h內，miR-NC組與miR-485-5p組甲狀腺癌SW579細胞OD值差異無統計學意義(P>0.05)。轉染48 h開始miR-485-5p組與miR-NC組相比，SW579細胞OD值差異有統計學意義(P<0.05)。Western印跡檢測結果顯示miR-485-5p組細胞增殖相關蛋白CyclinD1蛋白表達顯著低于miR-NC組(P<0.05)，而p21、p27蛋白表達顯著高于miR-NC組(P<0.05)，見圖2，表2。

表2 miR-485-5p過表達對甲狀腺癌SW579細胞增殖的影響

圖2 細胞增殖相關蛋白表達

2.3miR-485-5p過表達對甲狀腺癌SW579細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，miR-485-5p組SW579細胞凋亡率顯著高于miR-NC組(P<0.05)。Western印跡檢測結果顯示，與miR-NC組相比，miR-485-5p組SW579細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)，而Bax與cleaved-caspase-3蛋白均明顯升高(P<0.05)，見圖3、圖4、表3。

圖3 凋亡相關蛋白表達

圖4 細胞凋亡流式圖

表3 miR-485-5p過表達對甲狀腺癌SW579細胞凋亡的影響

2.4抑制FLOT2表達對甲狀腺癌SW579細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組相比，si-FLOT2組SW579細胞中FLOT2蛋白表達明顯降低(P<0.05)；轉染48 h后，si-FLOT2組SW579細胞OD值明顯降低(P<0.05)；si-FLOT2組SW579細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；Western印跡結果顯示CyclinD1與Bcl-2蛋白表達下調(P<0.05)，而p21與Bax蛋白表達上調(P<0.05)，見圖5、表4、表5。

圖5 FLOT2和增殖、凋亡相關蛋白表達

表4 抑制FLOT2表達對甲狀腺癌SW579細胞增殖和凋亡的影響

表5 抑制FLOT2表達對甲狀腺癌SW579細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的影響

2.5miR-485-5p靶向調控FLOT2的表達 雙熒光素酶報告實驗結果顯示WT-FLOT2與miR-485-5p mimic共轉染組SW579細胞熒光素酶活性(0.42±0.05)顯著低于WT-FLOT2與miR-NC共轉染組(1.04±0.08；t=16.098，P=0.000)，而MUT-FLOT2與miR-485-5p mimic共轉染組SW579細胞熒光素酶活性(1.03±0.09)與MUT-FLOT2與miR-NC共轉染組(1.01±0.07)相比差異無統計學意義(t=0.430，P=0.677)。Western印跡檢測結果顯示，miR-485-5p組FLOT2蛋白表達(0.22±0.03)顯著低于miR-NC組(0.63±0.06，P<0.05)，anti-miR-485-5p組(0.89±0.08)顯著高于anti-miR-NC組(0.61±0.05，P<0.05)，見圖6、圖7。

圖6 互補的核苷酸序列

圖7 miR-485-5p靶向調控FLOT2的表達

2.6FLOT2過表達逆轉了miR-485-5p過表達對甲狀腺癌SW579細胞增殖和凋亡的影響 Western印跡檢測結果顯示，miR-485-5p+pcDNA-FLOT2組SW579細胞中FLOT2蛋白表達明顯高于miR-485-5p+pcDNA組(P<0.05)。與miR-485-5p+pcDNA組相比，MTT檢測結果顯示在共轉染培養48 h后miR-485-5p+pcDNA-FLOT2組SW579細胞OD值顯著升高，而細胞凋亡率顯著降低，Western印跡結果顯示CyclinD1與Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)，而p21與Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)見圖8、表6、表7。

圖8 FLOT2和增殖、凋亡相關蛋白表達

表6 FLOT2過表達逆轉了miR-485-5p過表達對甲狀腺癌SW579細胞增殖和凋亡的影響

表7 FLOT2過表達逆轉了miR-485-5p過表達對甲狀腺癌SW579細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的影響

3 討 論

甲狀腺癌患者早期臨床癥狀較隱匿，目前臨床主要采用手術與非手術治療，可在一定程度上改善患者臨床癥狀，但早期診斷及治療方法均具有一定局限性導致甲狀腺癌患者死亡率升高〔7，8〕。甲狀腺癌發生及發展涉及多種基因或信號通路蛋白，因此探究甲狀腺癌發病機制對尋找早期診斷及治療甲狀腺癌的分子標志物具有重要指導意義。miRNA可調控細胞增殖及凋亡，研究顯示miRNA可影響甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲等惡性生物學過程〔9〕。因此，尋找甲狀腺癌發生及發展相關的miRNA對揭示其發病機制及提高靶向治療效果均具有重要意義。

miR-485-5p在結直腸癌細胞中呈低表達并可抑制癌細胞增殖及侵襲〔10〕，梁昆等〔11〕研究表明通過上調miR-485-5p表達可有效抑制前列腺癌細胞增殖。胃癌組織及細胞中miR-485-5p表達下調，上調miR-485-5p表達可通過抑制靶基因FLOT1表達進而抑制胃癌細胞增殖、遷移及侵襲〔12〕。乳腺癌細胞中miR-485表達水平降低，上調miR-485表達后可抑制乳腺癌細胞遷移及侵襲〔13〕。Chen等〔14〕研究表明miR-485-5p過表達后可通過靶向調控高遷移率族蛋白(HMGA)2表達進而抑制膀胱癌細胞侵襲。由此猜測miR-485-5p在甲狀腺癌細胞中呈低表達并可發揮抑癌基因作用。本研究結果說明miR-485-5p表達水平降低可促進甲狀腺癌發生。通過上調miR-485-5p表達后發現SW579細胞增殖活性明顯降低，CyclinD1蛋白表達明顯降低，而p21與p27蛋白表達明顯升高，p21與p27屬于細胞周期依賴性激酶抑制因子家族成員，并可抑制CyclinD1與細胞周期依賴性激酶結合〔15〕。提示miR-485-5p過表達可上調p21與p27蛋白表達水平，抑制CyclinD1蛋白表達，促使SW579細胞周期阻滯，抑制細胞增殖。但關于其是否通過誘導細胞周期阻滯還需通過流式細胞術檢測細胞周期。Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白，Bax表達上調可激活cleaved-caspase-3蛋白表達進而誘導細胞凋亡〔16〕。本研究結果提示miR-485-5p過表達可上調Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達，并抑制Bcl-2蛋白表達進而誘導SW579細胞凋亡。

FLOT2在鼻咽癌細胞中表達上調，抑制FLOT2表達可能通過轉化生長因子(TGF)-β信號通路進而抑制鼻咽癌細胞遷移及侵襲〔17〕。 FLOT2作為細胞膜重要組成成分，范雙石等〔18〕研究表明 FLOT2在喉鱗狀細胞癌中呈高表達，并可能與癌癥發生進展及患者不良預后有關。本研究結果提示 FLOT2可能參與甲狀腺癌發生過程。研究報道沉默 FLOT2表達可通過上調p21、p27蛋白表達進而抑制乳腺癌細胞增殖〔19〕。本研究提示抑制FLOT2表達可有效降低SW579細胞增殖能力并提高細胞凋亡水平。相關研究表明miR-485可通過抑制磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/mTOR信號通路而抑制靶基因 FLOT2表達，進而抑制肺腺癌細胞遷移及侵襲〔20〕。本研究雙熒光素酶報告基因實驗驗證FLOT2是miR-485-5p的靶基因，在miR-485-5p mimic轉染的SW579細胞中加入pcDNA-FLOT2質粒可逆轉miR-485-5p過表達對甲狀腺癌細胞增殖及凋亡的作用，提示miR-485-5p可通過作用于靶基因FLOT2抑制甲狀腺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。

綜上，miR-485-5p在甲狀腺癌細胞中下調表達，FLOT2上調表達，miR-485-5p過表達可通過靶向FLOT2抑制甲狀腺癌細胞增殖并促進細胞凋亡，為揭示甲狀腺癌發病機制提供新思路，并可能作為臨床靶向治療甲狀腺癌的潛在靶點。