響應面法優化小鼠急性衰老模型

劉詩音 尹鵬

(1長春醫學高等專科學校，吉林 長春 130031；2吉林大學中日聯誼醫院)

建立科學的并能夠用于臨床研究衰老過程的動物模型，對于現階段研究老年性相關疾病的發病機制及致病原因十分重要。衰老動物模型的建立，也是當今醫藥企業研發抗衰老藥物、藥品的安全性檢查實驗及藥品有效性檢定所必需的前提。自然衰老鼠模型具有最符合人類衰老特點的優點，但這一模型存在一些不足：如老年鼠飼養條件及時間不統一、采購價格昂貴、健康狀況參差不齊，實驗過程死亡率高，在個體對藥物的吸收、代謝、分布上的變異性大。因此，鼠的人工衰老模型被廣泛使用并通過各種方法研究其制備工藝。人工衰老鼠模型是指通過人為因素致衰老，構建符合實驗要求的鼠模型〔1〕，主要方法包括D-半乳糖給藥法〔2〕、β淀粉樣蛋白注射法〔3〕、快速老化小鼠〔4〕、γ射線照射法〔5〕等。本文選擇γ射線照射法構建衰老模型，此法是根據細胞衰老過程中的自由基理論，通過照射γ射線〔6〕，使小鼠體內的丙二醛(MDA)含量持續在一個高水平，MDA指標可以有效反映出氧化損傷的程度。隨著機體年齡的增大，MDA的含量呈明顯的上升趨勢，所以MDA的含量與機體衰老狀況顯著相關。

1 材料與方法

1.1材料 二級小鼠，由長春醫學高等專科學校食品藥品學院提供。

1.2方法

1.2.1小鼠急性衰老模型的制作〔7～10〕體重為(18±2)g的雄性二級小鼠 45只，根據隨機分組要求分為3組，每組各15 只。A 組為空白對照組，正常喂養；B組給予每只小鼠3.5 Gy 的全身照射(照射面積：25 cm×25 cm，照射源距動物的高度：100 cm，每次照射時間：90 s)，每10 d 照射1次，共5次，總計 17.5 Gy； C 組給予每只小鼠6 Gy 的全身照射(照射面積：25 cm×25 cm，照射源距動物的高度：80 cm，每次照射時間：90 s)，每15 d照射1次，共3次，總計18 Gy；所有小鼠普通飼料喂養，自由飲食，測量體重變化。飼養80 d后斷頭處死，取肝，并記錄重量。

1.2.2MDA的檢測〔11,12〕

1.2.2.1樣品的制作 取樣品20 μl，加入0.04 mol/L硫酸4.0 ml，加入10%磷烏酸500 μl，搖勻放置5 min后，3 000 r/min離心10 min，棄上清。加入0.04 mol/L硫酸2.0 ml，加入10%磷烏酸300 μl，搖勻放置5 min后，2 000 r/min離心10 min，棄上清。加雙蒸水1 ml，0.67%硫代巴比妥酸1 ml，混勻，水浴煮沸1 h后冷卻至室溫，加入正丁醇4.0 ml，震蕩抽提1 min，3 000 r/min離心10 min，取上清3.0 ml，測定熒光強度。

1.2.2.2標準溶液的制備 分別取1 μmol/L MDA 標準品 1.000 00 ml、0.500 00 ml、0.250 00 ml、0.125 00 ml、0.062 50 ml、0.031 25 ml，不足1.000 00 ml的，用三蒸水補足至1.000 00 ml。

1.2.2.3空白溶液的制備 取三蒸水1 ml，加入硫代巴比妥酸1 ml，50℃水浴保存至測定。

1.2.3影響小鼠肝臟MDA含量的單因素實驗〔13〕

1.2.3.1輻照吸收劑量對小鼠肝臟MDA含量的影響 照射面積：25 cm×25 cm，照射源距動物的高度：80 cm，每次照射時間：90 s，每10 d 照射1次，共5次，輻照吸收劑量1.0 Gy、3.5 Gy、6.0 Gy時MDA的含量。

1.2.3.2輻照源距動物高度對小鼠肝臟MDA含量的影響 3.5 Gy 全身輻照，照射面積：25 cm×25 cm，每次照射時間90 s，每10 d照射1次，共5次，照射源距動物的高度為60 cm、80 cm、100 cm條件下MDA的含量。

1.2.3.3連續輻照時間對小鼠肝臟MDA含量的影響 3.5Gy全身輻照，照射面積：25 cm×25 cm，照射源距動物的高度：80 cm，每次照射時間90 s，每5 d、10 d、15 d照射1次共5次照射時MDA的含量。

1.2.4響應面優化〔14，15〕在單因素試驗的基礎上，選取輻照吸收劑量、輻照源距動物高度、連續輻照時間作為自變量，MDA含量為因變量。通過進行響應面優化建立小鼠衰老模型的最佳條件。見表1。

表1 試驗因素及水平表

1.2.5數據統計與分析〔16，17〕采用Design-Expert8.0軟件處理數據，根據單因素試驗結果選取輻照吸收劑量、輻照源距動物高度、連續輻照時間3個因素作試驗因素，以MDA的含量為響應值進行試驗設計。每個實驗做3次平行。通過考察F值(P<0.05)及每個具有顯著性的因素，通過回歸方程和響應面分析每個因素之間的交互作用是否具有顯著性。

2 結 果

2.1各組小鼠一般情況 A組小鼠的體重有所增加，B組和C組的小鼠體重增長緩慢，并表現出行動遲緩、狀態萎靡等現象；3只C組小鼠死亡。

2.2MDA含量變化 B組〔(12.78±1.21)mmol/mg〕、C組〔(12.31±1.77)mmol/mg〕的肝MDA含量均顯著高于A組〔(9.57±1.13)mmol/mg,P<0.05〕。

2.3單因素實驗

2.3.1輻照吸收劑量對小鼠肝臟MDA含量的影響 輻照吸收劑量為1.0、3.5、6.0 Gy時的MDA含量分別為(10.3±0.71)mmol/mg、(13.8±0.98)mmol/mg、(13.3±0.83)mmol/mg；在輻照吸收劑量大于1 Gy時，MDA含量隨著輻照吸收劑量的增加強度不斷增加，大于3.5 Gy MDA含量逐漸降低。因此在其他的反應條件確定時最佳輻照吸收劑量為3.5 Gy。

2.3.2輻照源距動物高度對小鼠肝臟MDA含量的影響 照射源距動物高度為60、80、100 cm時，MDA含量分別為(10.4±0.69)mmol/mg、(13.8±1.01)mmol/mg、(12.3±0.95)mmol/mg；輻照源距動物高度為80 cm時，MDA含量達到最高值。然而輻照源距動物高度過高或過低，MDA含量降低。所以在其他的反應條件確定時MDA含量的最佳輻照源距動物高度為80 cm。

2.3.3連續輻照時間對小鼠肝臟MDA含量的影響 連續照射時間5、10、15 d時，MDA含量分別為(12.7±0.84)mmol/mg、(14.0±1.18)mmol/mg、(12.5±0.83)mmol/mg；連續輻照時間為10 d時MDA最高。所以在其他的反應條件確定時MDA含量的最佳連續輻照時間為10 d。

2.4二次響應面回歸模型的建立及顯著性檢驗 根據表2的試驗數據，對自變量編碼輻照吸收劑量(X1)、輻照源距動物高度(X2)和連續輻照時間(X3)進行回歸分析，并由Design-Expert8.0.5.0擬算出二次多項回歸方程。

表2 響應面實驗設計與結果

根據表3方差分析可得出，因素X1、X2、X3、X2X3、X12、X22及X32對MDA含量的影響極其顯著(P<0.01)；因素X1X3對MDA含量的影響顯著(P<0.05)；因素X1X2、X2對MDA 含量的影響不顯著(P>0.05)。

表3 回歸模型的ANOVA分析

影響MDA含量的因素，可根據二次多項回歸方程一次項系數的大小判斷依次為：輻射吸收度、連續照射時間和輻射源高度。通過以上判斷可以說明，連續照射時間對MDA 含量的影響最顯著。方差分析結果如表3，失擬項的P值>0.05，差異不顯著，模型的F檢驗值為404.98，P值<0.000 1，差異性極顯著，說明該模型與實際試驗擬合較好，可用于對MDA 含量的理論預測。

通過響應面法優化出在輻照吸收劑量3.5 Gy，輻照面積25 cm×25 cm，輻照源距動物高度為80 cm，每次輻照90 s，連續輻照時間10 d， MDA含量達到最大值， MDA含量達到14 mol/mg。

2.5兩因素交互作用分析

2.5.1輻照吸收劑量與輻照源距動物高度的交互作用 根據圖4可知，當輻照吸收劑量與輻照源距動物高度發生變化時，MDA含量也隨之發生變化。當輻照吸收劑量達到3.5 Gy，輻照源距動物高度約為80 cm時，MDA含量也相對最高。超過此范圍，得率則下降。說明輻照吸收劑量與輻照源距動物高度過大都不會使MDA含量的增強，故本試驗中輻照吸收劑量與輻照源距動物高度交互作用不顯著。

圖4 輻照吸收劑量與輻照源距動物高度的交互作用對MDA含量的響應面圖

2.5.2輻照吸收劑量與連續照射時間的交互作用 由圖5可知，當連續照射時間一定的條件下，MDA含量隨輻照吸收劑量增大或減小而呈現明顯增大或減小趨勢。而在輻照吸收劑量一定的條件下MDA含量隨連續照射時間變化略有不同。故本試驗中輻照吸收劑量與連續照射時間交互作用顯著。

圖5 輻照吸收劑量與連續照射時間的交互作用對MDA含量的響應面圖

2.5.3輻照源距動物高度與連續照射時間的交互作用 由圖6可知，當輻照源距動物高度一定的條件下，MDA含量隨連續照射時間長短而呈現明顯的增大或減小趨勢。而在連續照射時間一定的條件下MDA含量隨輻照源距動物高度的變化而變化。故本試驗中輻照源距動物高度與連續照射時間交互作用極為顯著。

圖6 輻照源距動物高度與連續照射時間的交互作用對MDA含量的響應面圖

3 討 論

本文利用γ射線照射的方法，確定小鼠衰老模型的建立條件為：輻照吸收劑量3.5 Gy，輻照面積25 cm×25 cm，輻照源距動物高度為80 cm，每次輻照90 s，連續輻照時間10 d，小鼠肝臟中MDA含量達到最大值。利用響應面法設計建模，可以有效減少試驗次數。利用 Design-Export 軟件進行響應面法設計試驗，可深入分析小鼠衰老模型的適應性、系數之間的顯著性。在提出優化試驗方案的同時，更好地解決了響應面法在設計與優化試驗過程中遇到的諸多問題。MDA與游離氨基結合生成脂褐素是目前比較廣泛的衰老生物學標志物。現在研究階段較為常用的致衰老模型為D—半乳糖給藥法，這種方法在制備衰老模型時能夠有較好的效果。但D-半乳糖給藥法在實際操作中會出現工作量較大的問題，而且在注射給藥時，因操作不當會導致小鼠感染或死亡。根據衰老過程中細胞衰老的自由基理論，通過γ射線長期照射小鼠，使小鼠體內產生大量自由基，引起生物膜的損傷，造成衰老。γ射線照射法可利用器具將小鼠準確固定在照射范圍，對于照射劑量、輻射源高度等條件均能確定，實驗過程可控性較高于D—半乳糖給藥法。但實驗用時較長及γ射線的安全性需要多加考慮。在數據統計過程中， SPSS統計軟件無法很好地分析小鼠衰老模型的適應性、系數之間的顯著性。而響應面法除了可以深入分析之外，還能優化出最佳的試驗方案，所以響應面法可以在今后的實驗中廣泛使用。