miR-219a-5p通過調控NEK6基因表達抑制視網膜母細胞瘤增殖、遷移和侵襲的機制

吳育芝 劉偉仙 林智

(1海口市第三人民醫院眼耳鼻咽喉科，海南 ?？?571100；2海南醫學院第一附屬醫院眼科)

視網膜母細胞瘤(RB)是原發于視網膜的惡性腫瘤，對患者的視功能造成嚴重損害，嚴重時可危及生命〔1〕。由于發病初期，腫瘤體積較小且位于視網膜的周邊，難以及時發現，易出現漏診〔2〕。臨床主要采用放療、化療、眼球摘除手術等方法進行治療，雖然治療方法不斷改善，但治療療效依然有限〔3〕。微小RNA(miRNA)是一類高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，長度為18～25個核苷酸，可通過與靶基因互不結合調控靶基因的表達，在腫瘤的發生、發展中發揮調控作用〔4〕。研究顯示，miR-219-5p在膠質母細胞瘤中表達下調，miR-219-5p過表達抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移，其靶向表皮生長因子受體(EGFR)表達調控RTK途徑影響膠質瘤細胞的生物學功能〔5〕。miR-219-5p在黑素瘤組織和細胞系中表達顯著降低，其低表達的黑素瘤預后較差，上調miR-219-5p表達可能通過靶向Bcl-2抑制黑素瘤細胞的生長和轉移，并增強其化學敏感性〔6〕。目前，miR-219-5p在RB中的表達及對其增殖、遷移和侵襲的影響還未見報道。本研究探討miR-219-5p在RB細胞Y79的表達情況及其對Y79細胞增殖、遷移和侵襲的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞和實驗試劑 人正常視網膜血管內皮細胞系ACBRI-181和人視網膜母細胞瘤細胞系Y79細胞，美國ATCC公司；胎牛血清和RPMI1640培養基，美國Gibco公司；Trizol試劑、PCR試劑盒和LipofectamineTM2000試劑盒，美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒，TOYOBO公司；引物序列和質粒載體，廣州市復能基因有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒，北京雷根生物技術有限公司；NEK6、周期蛋白依賴性激酶(CDK)1和細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體，美國Santa Cruz公司；基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和β-actin抗體，中國北京BIO-SYNTHESIS公司；辣根過氧化酶標記的二抗，Fermentas公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)，美國Sigma公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒，北京百奧萊博科技有限公司。

1.2細胞培養和轉染 Y79細胞和ACBRI-181細胞均使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養，細胞融合至80%左右時，胰酶消化制成單細胞懸液，進行傳代培養或用于后續實驗。Y79細胞接種于6孔板內(1×105個/孔)，細胞融合度達60%時，采用脂質體法分別轉染miR-con、miR-219a-5p mimics、si-con、si-NEK6及共轉染miR-219a-5p mimics與pcDNA、miR-219a-5p mimics與pcDNA-NEK6。轉染后12 h，更換新鮮含胎牛血清的RPMI1640培養基，繼續培養至48 h，收集各組細胞用于后續實驗。

1.3qRT-PCR檢測miR-219a-5p和NEK6 mRNA表達 參照Trizol試劑操作說明提取細胞中總RNA，測定純度和濃度之后，參照逆轉錄試劑盒操作說明逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按照PCR試劑盒說明進行擴增。反應條件：95℃預變性5 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環。miR-219a-5p以U6為內參，NEK6以β-actin為內參，采用 2-△△Ct法計算miR-219a-5p和NEK6 mRNA的相對表達水平。

1.4Western印跡檢測蛋白表達 加入細胞裂解液，置于冰上充分裂解30 min提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每個樣本30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜后，加入ECL顯影，曝光拍照。Quantity One軟件分析，以目的蛋白條帶的灰度值和內參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.5MTT檢測細胞增殖 轉染后的Y79細胞，以每孔103個細胞接種于96孔板中，每組設置3個復孔，置于培養箱中分別培養24、48和72 h。培養結束后，每孔加入20 μl MTT，繼續孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μl DMSO，混合均勻，用酶標儀測定每孔在490 nm處的OD值。

1.6Transwell檢測細胞遷移和侵襲 細胞遷移實驗：轉染后的Y79細胞，用不含胎牛血清的RPMI1640培養基制成單細胞懸液，調整濃度為1×105個/ml，取100 μl直接加入 Transwell小室的上室，下室加入500 μl含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養基，置于培養基中培養48 h。取出小室，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，棉簽擦去上室內層細胞，經甲醛固定、結晶紫染色后顯微鏡觀察。隨機選取5個視野計算細胞數，實驗重復3次。細胞侵襲實驗中Transwell小室的上室預先鋪基質膠，其余與遷移實驗操作相同。

1.7雙熒光素酶報告基因實驗驗證 Target Scan等生物信息學軟件預測結果顯示，NEK6是miR-219a-5p的靶基因。分別構建野生型(WT)及突變型(MUT)NEK6 3′UTR的報告基因pGL3質粒，用脂質體法分別將NEK6 3′UTR-WT+miR-219a-5p mimics、NEK6 3′UTR-WT+miR-con、EK6 3′UTR-MUT+miR-219a-5p mimics、NEK6 3′UTR-MUT+miR-con轉染至Y79細胞，48 h后，參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-219a-5p和NEK6在人視網膜母細胞瘤細胞Y79與正常人視網膜血管內皮細胞ACBRI-181中的表達 與ACBRI-181細胞比，Y79細胞中miR-219a-5p表達水平顯著降低(P<0.05)，NEK6 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖1，表1。

表1 miR-219a-5p和NEK6在Y79細胞和ACBRI-181細胞中的表達

圖1 NEK6蛋白表達

2.2過表達miR-219a-5p對Y79細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-con組比，miR-219a-5p組Y79細胞miR-219a-5p表達水平顯著升高(P<0.05)，說明miR-219a-5p過表達的Y79細胞構建成功。MTT結果顯示，與miR-con組比，miR-219a-5p組Y79細胞培養48 h和72 h時，細胞OD值顯著降低(P<0.05)。Transwell檢測結果顯示，與miR-con組比，miR-219a-5p組Y79細胞遷移和侵襲數均顯著降低(P<0.05)，見圖2，表2。

圖2 Y79細胞遷移和侵襲的細胞數(結晶紫，×100)

表2 抑制miR-219a-5p表達對Y79細胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.3miR-219a-5p過表達對Y79細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達的影響 與miR-con組比，miR-219a-5p組Y79細胞CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 Y79細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達

表3 miR-219a-5p過表達對Y79細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達的影響

2.4miR-219a-5p靶向調控NEK6的表達 Target Scan在線靶基因預測工具顯示，NEK6的3′UTR中含有與miR-219a-5p互補的核苷酸序列(圖4)。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-219a-5p+NEK6-WT組熒光素酶活性(0.58±0.08)顯著低于miR-con+NEK6-WT組(1.00±0.11；t=9.264,P=0.000)，而miR-219a-5p+NEK6-MUT組與miR-con+NEK6-MUT組熒光素酶活性(1.16±0.16、0.93±0.09)差異無統計學意義(P>0.05)，說明miR-219a-5p靶向調控NEK6表達。與miR-con組(0.53±0.06)比，miR-219a-5p組Y79細胞中NEK6蛋白(0.19±0.03)顯著降低(P<0.05)；而與anti-miR-con組(0.63±0.07)比，anti-miR-219a-5p組(0.81±0.09)顯著升高(P<0.05)，進一步說明miR-219a-5p在Y79細胞中靶向負調控NEK6表達。

1～4：miR-con、miR-219a-5p、anti-miR-con、anti-miRV219a-5p圖4 NEK6的3′UTR中含有與miR-219a-5p互補的核苷酸序列

2.5抑制NEK6表達對Y79細胞增殖、遷移、侵襲的作用 與si-con組比，si-NEK6組Y79細胞NEK6蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，培養后48 h和72 h細胞OD值顯著降低(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數均顯著降低(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，見圖5，表4。

圖5 Y79細胞增殖相關蛋白和遷移相關蛋白表達

表4 抑制NEK6表達對Y79細胞增殖、遷移、侵襲及其相關蛋白的作用

2.6miR-219a-5p和NEK6表達對Y79細胞增殖、遷移、侵襲的作用 與miR-219a-5p+pcDNA組比，miR-219a-5p+pcDNA-NEK6組Y79細胞NEK6蛋白表達顯著升高(P<0.05)。與miR-219a-5p+pcDNA組比，miR-219a-5p+pcDNA-NEK6組Y79細胞培養48 h和72 h細胞OD值顯著升高(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數均顯著升高(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。見表5,圖6。

表5 miR-219a-5p和NEK6表達對Y79細胞增殖、遷移和侵襲及其相關蛋白的作用

1～4：miR-con組、miR-291a-5p組、miR-291a-5p+pcDNA組、miR-291a-5p+pcDNA-NEK6組圖6 Y79細胞增殖相關蛋白和遷移相關蛋白表達

3 討 論

RB是一種常見的眼內惡性腫瘤，多發生于兒童時期，約占兒童惡性腫瘤的3%〔7〕。由于早起診斷的局限性，兒童期腫瘤的死亡率較高〔8〕。多種miRNA在RB中表達異常，參與RB的發生和發展。miR-29a在RB組織和細胞系中表達下調，其過表達顯著抑制RB細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進RB細胞凋亡，miR-29a可能通過抑制STAT3對RB發揮腫瘤抑制作用〔9〕。miR-613在RB組織和細胞系中表達降低，miR-613過表達抑制RB細胞增殖、遷移和侵襲，并在體外誘導細胞周期停滯，miR-613通過下調E2F5在RB中起腫瘤抑制劑作用〔10〕。

miR-219-5p是一個與腫瘤高度相關的miRNA家族成員，目前已被證實其在非小細胞肺癌、胰腺癌、結直腸癌等多種腫瘤中異常表達〔11～13〕，影響腫瘤細胞的生物學功能，參與腫瘤的發生發展。本研究結果提示，miR-219-5p作為腫瘤抑制因子在RB中發揮作用，可能是RB治療的潛在靶點。細胞增殖依賴于細胞周期，Cyclin和CDK是調控細胞周期的重要蛋白〔14〕。細胞外基質和基底膜的降解是腫瘤細胞遷移和侵襲的基礎。MMP是一類能降解細胞外基質和基底膜的酶類，可促進腫瘤細胞的遷移和侵襲〔15〕。本研究結果提示，miR-219-5p能調控與Y79細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白的表達。

miRNA在腫瘤疾病中通過調控其下游靶基因表達發揮生物學作用〔16〕。Target Scan等靶基因在線預測工具顯示，miR-219a-5p可與NEK6的3′UTR中核苷酸序列互補結合，猜測miR-219a-5p可靶向調控NEK6表達。雙熒光素酶報告基因實驗證實了Y79細胞中miR-219a-5p靶向調控NEK6的表達。本研究結果說明miR-219a-5p靶向負調控NEK6表達。NEK6參與調控細胞周期〔17〕，研究顯示，NEK6在胃癌組織和細胞系中表達上調，與患者遠處轉移、淋巴結轉移和TNM分期等密切相關，下調NEK6表達可有效降低胃癌細胞的遷移和侵襲能力〔18〕。本研究結果與相關報道結果一致〔19〕，提示NEK6作為促腫瘤因子在RB中起重要作用，抑制其表達有助于RB的治療。研究還發現，NEK6過表達部分逆轉了miR-219a-5p過表達對Y79細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，進一步說明miR-219a-5p通過調控NEK6表達在RB中發揮腫瘤抑制作用。