miR-195-5p靶向HMBOX1調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖遷移侵襲及凋亡的機(jī)制

田由京 張浩 陳興超 李軍 李合

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科，海南 海口 570102)

微小RNA(miRNA)是在18～24個(gè)核苷酸組成的人類進(jìn)化中高度保守的穩(wěn)定遺傳的短鏈miRNA分子，其特征為不編碼蛋白質(zhì)。miRNA在人類的多種疾病中都可通過抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或蛋白翻譯而發(fā)揮一定的調(diào)控功能，如癌癥、糖尿病及其并發(fā)癥、神經(jīng)退行性疾病及其他各種疾病〔1〕。miR-195-5p不僅可通過靶向鋅指蛋白(ZNF)139調(diào)控胃癌細(xì)胞的耐藥性〔2〕，還參與胃癌細(xì)胞的細(xì)胞表型變化，但是其在胃癌中的作用機(jī)制是否與含有1的同源框(HMBOX)1相關(guān)尚且未知。HMBOX1在N-末端含有同源框結(jié)構(gòu)域，在C-末端含有HNF1-N結(jié)構(gòu)域，屬于同源框基因家族成員。HMBOX1在不同物種間高度保守〔3〕，并且在人10種正常組織的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中檢測到，包括大腦、胰腺、腎和肝〔4〕。最近研究報(bào)道，HMBOX1在癌癥中出現(xiàn)異常表達(dá)，其中包括胃癌〔5〕。本研究檢測miR-195-5p、HMBOX1在胃癌細(xì)胞的表達(dá)水平，評估二者對胃癌HGC-27細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響，并揭示miR-195-5p對HMBOX1的靶向作用，旨在闡明其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 正常胃上皮細(xì)胞(GES)-1、胃癌細(xì)胞N87、 SGC-7901、HGC-27均購自ATCC；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)(MTT)、胰蛋白酶均購自美國Sellect公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara公司；聚偏乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司； 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、ECL發(fā)光液和放射性免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液均購自碧云天生物技術(shù)公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室購自美國Coming公司；Annexin 異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素V/碘化丙啶(V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將GES-1、SGC-7901、N87、HGC-27細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中包含10%胎牛血清，并置于37℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育，觀察細(xì)胞生長至75%融合時(shí)，加入胰蛋白酶消化1 min，以1∶3的比例更換新鮮的培養(yǎng)基，每隔1 d傳代一次。

1.3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與細(xì)胞分組 將miR-NC、miR-195-5p、si-NC、si-HMBOX1、miR-195-5p和pcDNA、miR-195-5p和pcDNA-HMBOX1遵循脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000說明書轉(zhuǎn)染到HGC-27細(xì)胞中，分別標(biāo)記為miR-NC組、miR-195-5p組、si-NC組、si-HMBOX1組、miR-195-5p+pcDNA組、miR-195-5p+pcDNA-HMBOX1組，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中miR-195-5p、HMBOX1的表達(dá) Trizol法提取GES-1、SGC-7901、N87、HGC-27細(xì)胞樣本總RNA,RNA的定量采用Nano-Drop 2000微量分光光度計(jì)進(jìn)行測定。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，步驟依照試劑盒說明書進(jìn)行，合成cDNA。以cDNA為模板鏈，按照反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，收集Ct值，每個(gè)樣品收集3次重復(fù)的平均值，以2-△△Ct法計(jì)算定量結(jié)果，測定miR-195-5p、HMBOX1的相對表達(dá)水平。

1.5MTT法檢測細(xì)胞增殖 取1.3中各分組HGC-27細(xì)胞，加入20 μl的MTT溶液(5 g/L)，反應(yīng)3.5～4.0 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)，充分震蕩溶解結(jié)晶，檢測490 nm波長下的細(xì)胞吸光度(A)。

1.6Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中HMBOX1、survivin、MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá) 各分組HGC-27細(xì)胞中加入裂解液，在冰上裂解，30 min后12 000 r/min離心10 min。吸取上清于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水變性10 min。電泳后通過轉(zhuǎn)膜儀將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；將膜在5%脫脂奶粉中封閉，2 h后洗滌膜，加入目的蛋白Ⅰ抗，4℃孵育過夜，次日洗滌膜，加Ⅱ抗，4℃孵育2 h。加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液，曝光。

1.7Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲miR-195-5p與HMBOX1 在6孔板中接種HGC-27細(xì)胞，密度為106個(gè)/孔，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)其達(dá)到90%融合度時(shí)，更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。之后調(diào)整細(xì)胞密度為105個(gè)/ml，在上室添加100 μl，下室添加600 μl含血清的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)。24 h后取出小室，用無菌棉簽擦除上室內(nèi)的HGC-27細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，加入甲醇固定，30 min后加入0.1%結(jié)晶紫，染色20 min，PBS漂洗2次。置顯微鏡下觀察Transwell小室下表面附著的遷移細(xì)胞，隨機(jī)取3個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。

在Transwell小室上室鋪適量基質(zhì)膠，風(fēng)干后按照上述檢測步驟進(jìn)行操作。最后于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)小室下表面附著的侵襲細(xì)胞。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 用500 μl的結(jié)合緩沖液懸浮HGC-27細(xì)胞，分別加入5 μl的 Annexin V-/ FITC和5 μl的PI，避光反應(yīng)20 min，細(xì)胞經(jīng)300目銅篩過濾，在1 h內(nèi)立即于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。細(xì)胞凋亡率(%)= 早期凋亡率(%)+晚期凋亡率(%)。

1.9雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中miR-195-5p與HMBOX1的結(jié)合力 將HMBOX1 3′非編碼區(qū)(UTR)-野生型(WT)(含HMBOX1 3′UTR片段)和HMBOX1 3′ UTR-突變型(MUT)的熒光素酶報(bào)告載體，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑分別與miR-195-5p或miR-NC共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒技術(shù)手冊操作，分別記錄螢火蟲和海腎的熒光素酶激發(fā)值，以二者的比值分析miR-195-5p與HMBOX1之間的結(jié)合力。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析，t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1胃癌細(xì)胞中miR-195-5p、HMBOX1的表達(dá) 與GES-1組相比，SGC-7901組、N87組、HGC-27組細(xì)胞中miR-195-5p mRNA表達(dá)均明顯減少，而HMBOX1 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.05)。最適細(xì)胞選定為HGC-27細(xì)胞。見圖1，表1。

圖1 HMBOX1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

表1 miR-195-5p、HMBOX1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2過表達(dá)miR-195-5p對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-195-5p組胃癌HGC-27細(xì)胞中miR-195-5p表達(dá)明顯增加，細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞遷移和侵襲量明顯減少，細(xì)胞凋亡率顯著升高(均P<0.001)。見表2。

表2 過表達(dá)miR-195-5p對胃癌細(xì)胞增殖遷移侵襲及凋亡的影響

2.3兩組survivin、P21、MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較 與miR-NC組比較，miR-195-5p組胃癌HGC-27細(xì)胞的survivin、MMP2、MMP9、Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯降低，P21、Bax的蛋白表達(dá)則顯著升高(均P<0.001)。見表3，圖2。

表3 兩組survivin、P21、MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

圖2 過表達(dá)miR-195-5p的HGC-27細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.4miR-195-5p靶向HMBOX1 生物信息學(xué)分析預(yù)測結(jié)果如圖3所示，miR-195-5p與HMBOX1的部分堿基存在互補(bǔ)配對現(xiàn)象。miR-195-5p組WT-HMBOX1細(xì)胞熒光活性顯著低于miR-NC組，而兩組MUT-HMBOX1細(xì)胞熒光活性無顯著差異。見表4。Western與anti-miR-NC組(1.01±0.01)相比，anti-miR-195-5p組HGC-27細(xì)胞中HMBOX1蛋白表達(dá)(3.30±0.43)明顯升高；與miR-NC組(1.00±0.01)比較，miR-195-5p組HGC-27細(xì)胞中HMBOX1蛋白表達(dá)(0.21±0.02)顯著降低(均P<0.05)。見圖4。

圖3 miR-195-5p與HMBOX1的靶向結(jié)合位點(diǎn)

表4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1～4：anti-miR-NC組、anti-miR-195-5p組、miR-NC組、miR-195-5p組圖4 Western印跡檢測HMBOX1蛋白表達(dá)

2.5敲減HMBOX1對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移、侵襲與凋亡的影響 與si-NC組比較，si-HMBOX1組胃癌HGC-27細(xì)胞中HMBOX1表達(dá)顯著降低，細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和侵襲量均明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加及survivin、MMP2、MMP9和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少，P21和Bax蛋白表達(dá)顯著增加(均P<0.05)。見表5，表6，圖5。

表5 敲減HMBOX1對HGC-27細(xì)胞增殖遷移侵襲及凋亡的影響

表6 各組相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖5 敲減HMBOX1對HGC-27細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6過表達(dá)HMBOX1逆轉(zhuǎn)了miR-195-5p對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移、侵襲與凋亡的影響 與miR-195-5p組比較，miR-195-5p+pcDNA-HMBOX1組HGC-27細(xì)胞中HMBOX1表達(dá)明顯升高，細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和侵襲量均顯著增加，細(xì)胞凋亡率明顯降低，且survivin、MMP2、MMP9和Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著升高，P21和Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖6，表7、表8。

1～3：miR-195-5p組、miR-195-5p+pcDNA組、miR-195-5p+pcDNA-HMBOX1組圖6 過表達(dá)HMBOX1和miR-195-5p的HGC-27細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)

表7 過表達(dá)HMBOX1逆轉(zhuǎn)miR-195-5p對胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

表8 各組胃癌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討 論

miRNA在人類癌癥中的致癌或抑癌作用得到普遍認(rèn)可。miRNA可通過抑制信使RNA的轉(zhuǎn)錄或蛋白翻譯而發(fā)揮調(diào)控癌癥進(jìn)展的作用，但是其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極其復(fù)雜〔6〕。每個(gè)miRNA都可調(diào)控多個(gè)靶基因，而一個(gè)靶基因又可同時(shí)被多個(gè)miRNA調(diào)控〔7〕，這在一定程度上增加了miRNA作用機(jī)制研究的難度，也為miRNA在癌癥中的治療提供了難度。Wang等〔8〕發(fā)現(xiàn)，miR-195-5p在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平下調(diào)，且與堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，miR-195-5p通過下調(diào)bFGF，抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲及異種移植小鼠模型中的腫瘤生長，這可以通過重新引入bFGF來恢復(fù)，揭示miR-195-5p通過抑制bFGF抑制胃癌的腫瘤生長，提示miR-195-5p和bFGF可作為胃癌治療的潛在靶點(diǎn)。Wang等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-195-5p通過靶向三部分基序(TRIM)14基因，并調(diào)控蛋白激酶B(AKT)信號通路，從而在胃癌細(xì)胞中的上皮間質(zhì)化及遷移侵襲過程發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-195-5p表達(dá)明顯下調(diào)。過表達(dá)miR-195-5p對胃癌細(xì)胞HGC-27的增殖、遷移和侵襲能力具有抑制作用，這均與前人報(bào)道〔8，9〕相一致；此外，過表達(dá)miR-195-5p對胃癌細(xì)胞凋亡顯示出促進(jìn)作用，這是國內(nèi)外首次報(bào)道，為miR-195-5p在胃癌中的功能探索提供更充分的理論依據(jù)。進(jìn)一步的，生物信息學(xué)預(yù)測、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)研究表明，miR-195-5p靶向并負(fù)調(diào)控HMBOX1的表達(dá)，這也是首次發(fā)現(xiàn)在胃癌中miR-195-5p可靶向HMBOX1，推測這與miR-195-5p的作用機(jī)制關(guān)系密切。

HMBOX1在人類的多種癌癥中均出現(xiàn)異常表達(dá)，如在高漿液性卵巢癌中低表達(dá)并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖〔10〕，在肝癌中通過促進(jìn)自噬、抑制免疫逃避發(fā)揮抑肝癌作用〔11〕。Diao等〔12〕在胃癌的研究中報(bào)道，HMBOX1在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)異常上調(diào)，并與胃癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總生存期相關(guān)， HMBOX1在胃癌細(xì)胞中的過表達(dá)通過加速細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞遷移來增強(qiáng)細(xì)胞增殖，相反，沉默HMBOX1抑制了這些作用，此外，該研究還發(fā)現(xiàn)CD133的表達(dá)與胃癌組織中的HMBOX1呈顯著正相關(guān)，HMBOX1和CD133的共表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良顯著相關(guān)，特別是對于Ⅲ和Ⅳ期患者，揭示了HMBOX1在胃癌中上調(diào)并與胃癌細(xì)胞增殖和遷移的相關(guān)性，提示，HMBOX1聯(lián)合CD133可能有助于預(yù)測晚期胃癌患者的生存。谷軍保等〔13〕報(bào)道，在胃癌細(xì)胞中，HMBOX1的表達(dá)水平受miR-221的靶向負(fù)調(diào)控，進(jìn)而參與胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡的調(diào)控及裸鼠成瘤的生長。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Diao等〔12〕、谷軍保等〔13〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致；深入研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)HMBOX1后，miR-195-5p抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用被逆轉(zhuǎn)，這即說明miR-195-5p可靶向調(diào)控HMBOX1，更說明了HMBOX1也可逆向調(diào)控miR-195-5p的表達(dá)及功能。