石斛灌胃對(duì)非酒精性脂肪肝小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積的改善作用及其機(jī)制

梁鈺華，楊育輝，鄧曉冬，林成創(chuàng)

1 廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣州511400；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)數(shù)理工程研究院

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指無長期且大量酒精損傷以及其他明確的肝損傷因素所導(dǎo)致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積[1]，肝小葉是其病變的主要部位，一般常以慢性良性過程為主，嚴(yán)重時(shí)會(huì)發(fā)生肝臟及全身性并發(fā)癥。隨著NAFLD的發(fā)病范圍愈加廣泛，近年來很多國內(nèi)外學(xué)者對(duì)NAFLD的診斷及其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但目前尚缺乏有效治療方案。目前在NAFLD的治療中多使用熊去氧膽酸、吡格列酮、二甲雙胍、ω3脂肪酸、他汀類等藥物，但是長期使用會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)[2～5]。因此，尋求對(duì)NAFLD治療有效且無不良反應(yīng)的藥物已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。石斛為傳統(tǒng)中藥，可益胃生津、滋陰清熱，是中醫(yī)治療消渴證的傳統(tǒng)要藥。近年來，大量國內(nèi)外研究[6～8]表明,石斛有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、保肝、降血脂等作用。2018年6月2日～2019年12月7日，本研究觀察了石斛灌胃對(duì)NAFLD小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積的改善作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 小鼠、試劑與儀器 雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠40只，體質(zhì)量22～25 g，4周齡，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。電泳儀購自美國Bio-Rad公司，顯影儀購自美國Bio-Rad公司，全波長酶標(biāo)儀購自美國伯騰儀器有限公司，PCR儀購自美國Thermo賽默飛世爾科技公司，蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche公司，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，p-mTOR兔單克隆抗體、p-p70兔單克隆抗體、GAPDH兔單克隆抗體購自美國CST公司，DMEM培養(yǎng)基購自加拿大海克隆公司，甘油三酯(TG)試劑盒、總膽固醇(TC)試劑盒購自中生北控生物技術(shù)公司，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST/GOT)試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT/GOT)試劑盒購自南京建成生物技術(shù)公司，引物購自生工生物科技有限公司，SYBR?Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 NAFLD模型制備、分組及石斛給予方法 取10只C57BL/6J雄性小鼠作為正常對(duì)照組，普通飼料喂養(yǎng)，剩余30只小鼠用高糖高脂飼料連續(xù)飼養(yǎng)12周，建立NAFLD模型。將30只NAFLD模型小鼠隨機(jī)分成模型組、石斛低劑量組、石斛高劑量組，每組10只。石斛低劑量組、石斛高劑量組分別給予200 mg/(kg·d)、400 mg/(kg·d)石斛湯劑灌胃，模型組、正常組均灌服等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃14周。

1.3 各組小鼠總體狀態(tài)觀察 灌胃結(jié)束后，觀察各組小鼠體形、體質(zhì)量、腹圍、皮毛光澤度及活動(dòng)量等總體狀態(tài)。

1.4 各組小鼠血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測 灌胃結(jié)束后，各組小鼠禁食12 h，乙醚麻醉，眼下靜脈叢取血，室溫下靜置30 min使血液自然凝固，3 000 r/min離心15 min，分離出血清，采用生化測試試劑盒檢測血清TG、TC、AST、ALT。

1.5 各組小鼠肝臟組織病理觀察 灌胃結(jié)束后，水合氯醛麻醉后處死小鼠，取出肝臟，切取部分組織用10%甲醛固定48 h，脫水、包埋、切片、脫蠟后，用伊紅-蘇木素染液染色，透明封固，最后中性樹膠封片，于倒置相差顯微鏡下觀察。

1.6 各組小鼠肝臟組織中固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP-1c)mRNA、脂肪酸合成酶(FAS) mRNA檢測 采用PT-PCR法。取100 mg小鼠肝臟組織，加入1 mL TRIzol勻漿，加入0.2 mL CHCl3使蛋白變性并抑制RNase活性，混勻后4 ℃ 12 000 r/m離心10 min，吸取水相層液體與異丙醇等體積混合均勻，室溫靜置10 min，4℃ 12 000 r/m離心10 min，吸棄上清溶液，75%的乙醇洗滌沉淀2次，用DEPC水溶解RNA沉淀，測定RNA純度及濃度，將溶解后的RNA按試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95℃ 2 min，95℃、5s，60℃、32s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：SREBP-1c正向引物為5′-GACAGCCCAGTCTTTGAGGA-3′，反向引物為5′-CAGGACAGGCAGAGGAAGAC-3′；FAS正向引物為5′-TTCCGAGATTCCATCCTACG-3′，反向引物為5′-AGGCTCACAAACGAATGGAC-3′；GAPDH正向引物為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，反向引物為5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。以2-ΔΔCt法表示組織中目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 各組小鼠肝臟組織中p-mTOR蛋白檢測 采用Western Blotting法。取100 mg小鼠肝臟組織，加入500 μL的RIPA裂解液，勻漿混勻，4 ℃條件下12 000 r/m離心10 min，吸取上清液，BCA法定量后，將蛋白與上樣緩沖液混勻，100 ℃變性，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜，用5%BSA封閉1 h，分別加入p-mTOR一抗、GAPDH 4 ℃過夜，次日洗膜后二抗孵育2 h，TBST洗膜后進(jìn)行顯影，并分析蛋白灰度值，以目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值)表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠總體狀態(tài) 模型組小鼠體形明顯大于正常組，體質(zhì)量和腹圍也較正常組明顯增加，動(dòng)作自如，但皮毛粗糙失去光澤且易脫毛。石斛低劑量組、石斛高劑量組小鼠活動(dòng)量正常，活動(dòng)靈敏，精神正常，皮毛光澤。

2.2 各組小鼠血清TG、TC、AST、ALT比較 正常組小鼠血清TG、TC、AST、ALT分別為(0.72±0.15)、(0.83±0.18)、(2.51+0.19)、(1.89±1.78)mmol/L，模型組小鼠血清TG、TC、AST、ALT分別為(1.30±0.12)、(1.48±0.17)、(5.86+10.46)、(4.55±0.26)mmol/L，兩組相比，P<0.05。

模型組、石斛低劑量組、石斛高劑量組小鼠血清TG、TC、AST、ALT水平比較見表1。由表1可知，石斛低劑量組、石斛高劑量組小鼠血清TG、TC、AST、ALT水平均低于模型組(P均<0.05)，石斛高劑量組小鼠血清ALT水平低于石斛低劑量組(P<0.05)。

表1 模型組、石斛低劑量組、石斛高劑量組小鼠血清TG、TC、AST、ALT水平比較

2.3 各組小鼠肝臟組織病理變化 正常組小鼠的肝細(xì)胞排列有規(guī)則，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，界板分明平滑，其內(nèi)皮細(xì)胞、貯脂細(xì)胞未見明顯的增生；肝竇結(jié)構(gòu)清晰；肝臟中的肝細(xì)胞核居中，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，纖維結(jié)締組織無明顯增生，膽管完整。模型組小鼠肝細(xì)胞腫大，脂滴較多，并有脂肪囊腫形成。石斛低、高劑量組小鼠肝臟中脂肪肝轉(zhuǎn)態(tài)減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織病理變化

2.4 各組小鼠肝臟組織中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 正常組小鼠肝臟組織中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.05±0.01、1.03±0.04，模型組小鼠肝臟組織中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為7.63±0.38、5.05±0.34，兩組相比，P均<0.05。

模型組、石斛低劑量組、石斛高劑量組肝臟組織中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見表2。由表2可知，石斛低劑量組、石斛高劑量組小鼠肝臟組織中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于模型組(P均<0.05)，且石斛高劑量組小鼠肝臟組織中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于石斛低劑量組(P均<0.05)。

表2 模型組、石斛低劑量組、石斛高劑量組小鼠肝臟組織中SREBP1c mRNA、FAS mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 各組小鼠肝臟組織中p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 正常組小鼠肝臟組織中p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.16±0.01，模型組小鼠肝組織中p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.32±0.02，兩組相比，P<0.05。模型組、石斛低劑量組、石斛高劑量組肝臟組織中p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.32±0.02、0.17±0.01、0.21±0.02，組間相比，P均<0.05。

3 討論

NAFLD是我國第二大肝臟疾病，其發(fā)病率呈上升趨勢。NAFLD主要是由于體內(nèi)多余的脂質(zhì)在肝臟堆積，進(jìn)而引起肝臟脂肪變。早期的NAFLD病患并沒有明顯的機(jī)體病癥，但是如果病情加重，其病癥走勢會(huì)轉(zhuǎn)化為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等疾病[9]。

石斛是傳統(tǒng)中醫(yī)治療消渴癥的主要中藥材，可養(yǎng)陰、生津、止渴、清肺胃虛熱。研究[10]發(fā)現(xiàn)，石斛具有調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂平衡的作用。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛水提物可降低高脂血癥小鼠中LDL-C、TC水平，并提升高HDL-C水平；金釵石斛總生物堿可以通過上調(diào)Acox1、PPARα以及ATGL的表達(dá)，進(jìn)而抑制降低SREBP1表達(dá)，從而起到降血脂的作用[12]。

本研究中使用高糖高脂飼料造模，誘導(dǎo)小鼠生成NAFLD，引起小鼠肝臟TG、TC合成增加，成模后的小鼠鼠毛油濕粗糙、體型肥大、行動(dòng)較遲鈍。通過石斛給藥后，石斛低、高劑量組小鼠情況較模型組小鼠有所改善，說明石斛可以改善NAFLD小鼠的狀態(tài)，提高其精神狀態(tài)。NAFLD小鼠大量攝取脂肪，致使能量的過剩，TG、TC升高。而石斛能降低NAFLD小鼠血液中TG、TC含量，表明了石斛對(duì)NAFLD小鼠具有調(diào)節(jié)血脂的作用，降低其血脂代謝紊亂，改善血脂代謝的不良狀況。高糖高脂飼料會(huì)導(dǎo)致小鼠血脂紊亂，進(jìn)而增加了肝臟的代謝負(fù)擔(dān)，同時(shí)會(huì)對(duì)機(jī)體的心血管系統(tǒng)造成損害。本研究中發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血液中AST、ALT水平顯著上升，說明長期攝入高脂飼料后，模型組小鼠的肝臟可能受到損傷，肝功能異常。而石斛能顯著下降NAFLD小鼠血液AST、ALT水平，說明石斛對(duì)肝臟有保護(hù)作用。SREBPs是堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈家族的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)檢測到機(jī)體體內(nèi)的細(xì)胞膽固醇水平異常升高時(shí)，SCAP會(huì)感測到多余的膽固醇，SREBPs喪失其S1P和S2P應(yīng)答，進(jìn)而迅速改變其bHLH構(gòu)象，使ER膜停止ER運(yùn)輸小泡。SREBPs包括SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2。其中，SREBP-2是由人染色體22q13的基因編碼，SREBP-1a和-1c主要是由外顯子1指定1a和1c的，其替代轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)是來源于人染色體17p11.2的單個(gè)基因。其中，SREBP-1a主要介導(dǎo)膽固醇、脂肪酸和甘油三酯的合成，是SREBP的應(yīng)答基因[13]；而SREBP-1c主要功能是控制脂肪酸合成，主要分布在肝臟及大多數(shù)完整的組織中。研究[14]顯示，SREBP-lc可以調(diào)節(jié)多種與脂肪合成和葡萄糖代謝有關(guān)的基因，譬如Sl4、葡萄糖激酶(GK)、低密度脂蛋白(LDL)受體、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)等。脂肪酸合成酶(FAS)是由一條相對(duì)分子質(zhì)量為250 kDa的多肽鏈?zhǔn)孜蚕噙B形成的以二聚體為主要存在形式的多功能酶，存在于細(xì)胞漿中。FAS是一種合成脂肪酸的關(guān)鍵酶，它能影響生物的能量代謝，還能催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸,從而導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生體脂沉積作用。另外，F(xiàn)AS也是一種限速酶，在脂肪酸再生過程中起重要作用。有研究[15]用小鼠的肝臟進(jìn)行免疫組織化學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)FAS在小鼠肝臟中大量表達(dá)，特別是在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。另外，還有研究[16]如果FAS過表達(dá)，就會(huì)導(dǎo)致了生物體內(nèi)脂肪的沉積，進(jìn)而導(dǎo)致肥胖。本研究結(jié)果顯示，石斛能顯著下降NAFLD小鼠肝臟中SREBP1c、FAS的mRNA相對(duì)表達(dá)量，與相關(guān)研究結(jié)果一致。

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，mTOR信號(hào)通路具有促進(jìn)物質(zhì)代謝、參與細(xì)胞凋亡、自噬的作用。mTOR含有mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合體。有研究[17]表明，mTORC1 能調(diào)節(jié)SREBP信號(hào)通路的表達(dá)，主要是通過控制磷脂酸磷酸酶Lipinl的入核來進(jìn)行調(diào)控的。首先，mTORC1復(fù)合體去磷酸化后，激活lipinl前體并促進(jìn)其在核內(nèi)重塑，然后調(diào)節(jié)mTORC1對(duì)SREBP靶基因和核SREBP蛋白的影響[18]。在肥胖/胰島素抗性模型中，有研究[19，20]發(fā)現(xiàn)，mTORC1/SREBP通路介導(dǎo)脂質(zhì)的合成，主要是通過mTORC1引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)胰島素抵抗和SREBP-1c的裂解和激活，其機(jī)制是由于mTORC1過度激活將下調(diào)胰島素通過IRS的降解信令，同時(shí)促進(jìn)糖異生程序的進(jìn)行，并正向調(diào)節(jié)SREBP-1c蛋白，誘導(dǎo)體內(nèi)脂肪生成。本研究結(jié)果顯示，石斛能顯著下降NAFLD小鼠肝臟組織中p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量，與相關(guān)研究結(jié)果一致。

綜上所述，石斛灌胃可改善NAFLD小鼠的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積，其作用機(jī)制可能是與mTOR信號(hào)通路有關(guān)。