腦膠質瘤組織中腫瘤壞死因子受體1、丙酮酸脫氫酶復合物E2的表達變化及其臨床意義

柴宇飛，康凱，趙德強

鐵嶺市中心醫院，遼寧鐵嶺112000

腦膠質瘤是最常見的腦部腫瘤，占中樞神經系統腫瘤的40%以上[1]。研究[2]顯示，惡性腦膠質瘤患者的總體中位生存期約為15個月，預后較差，而復發、化療耐藥性及腦膠質瘤細胞高度侵襲的特性是影響其預后的重要因素[3，4]。腦膠質瘤的具體發病機制尚未明確，因此研究腦膠質瘤分子和基因的變化，尋找腦膠質瘤潛在治療靶點，對改善患者預后至關重要。腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)是腫瘤壞死因子受體家族成員。研究[5，6]報道，TNFR1在胰腺癌和慢性淋巴細胞白血病等多種腫瘤中高表達，并參與凋亡、增殖和侵襲轉移等生物學過程。丙酮酸脫氫酶復合物E2(PDC-E2)為調節糖代謝的關鍵酶亞基，目前其在腫瘤惡性生物學行為中的作用未知。研究[7]顯示，腫瘤快速增殖需要大量的能量，包括有氧糖酵解和氧化磷酸化，提示PDC-E2與腫瘤的發生發展密切相關。本研究通過檢測腦膠質瘤組織中TNFR1、PDC-E2的表達情況，分析兩者與腦膠質瘤患者臨床病理參數及預后的關系，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年1月～2014年8月鐵嶺市中心醫院收治的腦膠質瘤患者79例，患者男43例、女36例，年齡15～76(43.25±22.83)歲，<50歲者28例，≥50歲者51例，腫瘤直徑>5 cm者47例、≤5 cm者32例，病理類型為星形細胞瘤40例、膠質母細胞瘤39例，侵犯腦葉數<2個者49例、≥2個者30例，WHO腫瘤分級Ⅰ～Ⅱ級55例、Ⅲ級24例。患者均接受手術治療，術中留取腦膠質瘤組織及癌旁組織(距癌組織3 cm處)。納入標準：①首次手術并且術前未接受任何形式的抗腫瘤治療；②術后經病理認證為腦膠質瘤；③病例和隨訪資料完整。排除標準：①合并其他腫瘤；②患有嚴重急危重癥病；③合并其他腦部疾病。本研究患者均簽署知情同意書，且經醫院倫理委員會審核通過。

1.2 腦膠質瘤組織及癌旁組織中TNFR1、PDC-E2檢測方法 采用免疫組織化學法。取腦膠質瘤組織及癌旁組織樣本，福爾馬林液固定過夜，石蠟包埋、切片(厚度為4 μm)、二甲苯脫蠟、乙醇水化，在枸櫞酸鈉溶液中沸水高壓進行抗原修復3 min，放置于3%過氧化氫甲醇溶液中室溫避光30 min，加入非免疫羊血清室溫孵育1 h，滴加一抗工作液(TNFR1稀釋比為1∶1 000，PDC-E2稀釋比為1∶100，以PBS替代一抗作陰性對照)，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次、每次5 min，滴加二抗(稀釋比為1∶200)，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，加入3,3′-二氨基聯苯胺四氫氯化物顯色，蘇木素染色，沖洗完全后乙醇脫水、干燥、二甲苯透明和封片，顯微鏡下觀察并計算陽性表達率。陽性表達率=陽性表達組織標本數量/組織標本總數量×100%。TNFR1、PDC-E2在腦膠質瘤組織及癌旁組織中陽性染色均為棕黃色，TNFR1主要位于細胞膜，PDC-E2主要位于細胞質。按陽性細胞所占比例和染色程度綜合計分，其中無陽性細胞為0分，1%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，75%～100%為4分；無陽性著色為0分，淺棕黃色為1分，深棕黃色為2分，棕黃色為3分；二者之和≤3分為陰性表達，>3分為陽性表達。

1.3 隨訪及預后分析 對患者進行專業隨訪，隨訪時間為手術后1～60個月，方式為電話及門診跟蹤訪問，患者死亡或者時間截止時終止隨訪。根據腦膠質瘤組織中TNFR1、PDC-E2檢測結果，將患者分為TNFR1陽性表達組、TNFR1陰性表達組和PDC-E2陽性表達組、PDC-E2陰性表達組，分析TNFR1、PDC-E2陽性表達與腦膠質瘤患者預后的關系。

1.4 統計學方法 采用SPSS12.0統計軟件。計數資料比較用χ2檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析法。采用Kaplan-Meier生存曲線法分析TNFR1、PDC-E2陽性表達與腦膠質瘤患者預后的關系，組間生存率比較用Logrank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦膠質瘤組織及癌旁組織中TNFR1、PDC-E2陽性表達率比較 腦膠質瘤組織中TNFR1、PDC-E2陽性表達率分別為70.89%(56/79)、64.56%(51/79)，癌旁組織中TNFR1、PDC-E2陽性表達率分別為36.70%(29/79)、46.83%(37/79)，兩者相比，P均<0.05。

2.2 腦膠質瘤組織中TNFR1、PDC-E2陽性表達的相關性 腦膠質瘤組織中TNFR1、PDC-E2陽性表達呈正相關關系(r=0.653，P<0.05)。

2.3 TNFR1、PDC-E2陽性表達與腦膠質瘤患者臨床病理參數的關系 TNFR1、PDC-E2陽性表達與腦膠質瘤患者臨床病理參數的關系見表1。由表1可知，TNFR1、PDC-E2陽性表達與腦膠質瘤患者腫瘤直徑、WHO腫瘤分級有關(P均<0.05)，而與年齡、性別、病理類型、侵犯腦葉數無關(P均>0.05)。

表1 TNFR1、PDC-E2陽性表達與腦膠質瘤患者臨床病理參數的關系(例)

2.4 TNFR1、PDC-E2陽性表達與腦膠質瘤患者預后的關系 TNFR1陽性表達組56例、TNFR1陰性表達組23例，Kaplan-Meier分析結果顯示，TNFR1陽性表達組5年生存率為30.36%，TNFR1陰性表達組5年生存率為65.22%，兩組相比，P<0.05。PDC-E2陽性表達組51例、PDC-E2陰性表達組28例，Kaplan-Meier分析結果顯示，PDC-E2陽性表達組5年生存率為31.37%，PDC-E2陰性表達組5年生存率為57.14%，兩組相比，P<0.05。

3 討論

腦膠質瘤是最常見的中樞神經系統腫瘤，發病率每年增加3%，發病人群也逐漸年輕化。腦膠質瘤治療方式主要是化學治療，近年來雖然術后放療、化療及免疫治療的聯合應用取得了一定的療效，但是由于腦膠質瘤細胞具有生長快、易沿白質纖維侵襲、浸潤蔓延的特性，使得腦膠質瘤患者復發率極高，導致患者預后較差。目前，腦膠質瘤具體發病機制仍然未知，隨著科學技術的不斷進步，尤其是基因技術的研究，腦膠質瘤分子水平的發病機制也取得了一定進展。因此，研究與腦膠質瘤發病密切相關基因的變化，對尋找治療腦膠質瘤候選靶點提供了理論依據。

TNFR是炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的受體，TNF-α主要作用為調控血管內皮生長因子(VEGF)的表達，VEGF在腫瘤的增殖、侵襲轉移中發揮重要作用。研究[8]報道，TNF-α在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的發生發展以及侵襲轉移中均有重要作用。而TNF-α調節腫瘤生物學惡性行為需要與兩個不同的受體TNF-α的受體1(TNFR1)和TNF-α的受體2(TNFR2)的結合，TNFR1廣泛表達于所有細胞中，TNFR2僅在免疫細胞表面表達，且TNFR1在介導下游信號通路的活化作用明顯較強。同時研究[9]表明，TNFR1在宮頸癌、乳腺癌和肝癌等多種惡性腫瘤中高表達。同時一項較大的前瞻性臨床研究[10]表明，腦膠質瘤患者血漿中可溶性TNFR1水平升高的患者生存期較短。本研究發現，TNFR1陽性表達率在腦膠質瘤患者組織標本中增加，在WHO腫瘤分級級別較高及直徑較大的腦膠質瘤患者組織中TNFR1陽性表達率較高。TNFR1作為TNF-α的主要受體，而TNFR1受TNF-α的調節參與腫瘤的發生，因此TNFR1可能是與TNF-α結合調控多條信號途徑而參與腦膠質瘤的進展。生存曲線結果顯示，TNFR1陽性表達者生存期較短，提示TNFR1在腦膠質瘤中可能發揮促癌作用，可能是腦膠質瘤患者預后不良的分子標志物。

腫瘤快速增殖需要大量的能量，能量的產生包括有氧糖酵解和氧化磷酸化代謝過程，而腫瘤的代謝也是近幾年的研究熱點，其中代謝關鍵酶是催化糖酵解的關鍵。PDC-E2為調節糖代謝的關鍵酶亞基，將丙酮酸轉化為乙酰輔酶A，用于線粒體呼吸的氧化磷酸化。同時，PDC-E2作為線粒體內膜上的抗原，表達于所有有核的細胞中，PDC-E2在凋亡的細胞中會降解，而PDC-E2降解出現異常時可引起自身免疫性疾病。PDC-E2在腫瘤中的惡性進展研究甚少，新近研究[11]表明，PDC-E2可以與信號轉導子和轉錄激活子5(STAT5)直接結合，而JNK/STAT信號通路參與調節腫瘤惡性行為，包括促進增殖、促進侵襲轉移、抑制凋亡等多種過程，因此PDC-E2可能參與腫瘤的發生發展。本研究結果表明，PDC-E2陽性表達率在腦膠質瘤患者中升高，生存曲線結果顯示，PDC-E2陽性表達者生存期較短，且在WHO腫瘤分級級別較高及直徑較大的腦膠質瘤患者組織中PDC-E2陽性表達率高，提示PDC-E2在腦膠質瘤中可能發揮促癌作用，可能是腦膠質瘤患者預后不良的分子標志物。

同時，本研究結果顯示，TNFR1與PDC-E2在腦膠質瘤組織中的陽性表達成正相關。林素平等[12]報道，TNFR1和PDC-E2在腦膠質瘤細胞中共同促進細胞的凋亡，具有協同作用，與本研究的結果具有一定的相似性。但是，本研究未在細胞水平對TNFR1與PDC-E2在腦膠質瘤細胞中發揮的具體作用進行研究，后續仍需進行探討。此外，本研究的實驗樣本數量較少，仍需擴大樣本量深入進行驗證，以得到更可靠的結論。

綜上所述，與癌旁組織相比，腦膠質瘤組織中TNFR1、PDC-E2陽性表達率升高；腦膠質瘤組織中TNFR1、PDC-E2陽性表達呈正相關關系，并與腫瘤直徑、WHO腫瘤分級有關，TNFR1、PDC-E2陽性表達的腦膠質瘤患者術后生存率較低。TNFR1及PDC-E2在促進腦膠質瘤發生發展中可能發揮協同作用，可能是評估腦膠質瘤預后的分子標志物和治療潛在靶點。