鐮形棘豆總黃酮灌胃對乙型肝炎大鼠肝損傷的改善作用及其機制

趙興輝，葉柳鳳，林小田

南部戰區海軍第一醫院，廣東湛江524000

乙型肝炎(乙肝)是我國常見的傳染疾病，由乙型肝炎病毒感染引起，致病率高，病程長，預后差，近年來發病率逐年增高[1，2]。研究[3，4]顯示，抑制肝內炎癥發生、減緩肝纖維化進程是乙肝臨床治療的關鍵。鐮形棘豆總黃酮是藏藥鐮形棘豆的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抑菌的作用，并可降低纖維化基因的表達，抑制TGF-β1誘導的人腎小管上皮細胞纖維化，因而推測鐮形棘豆總黃酮可能通過抑制炎癥、緩解肝纖維化而對乙肝大鼠發揮保護作用[5，6]。TGF-β1是具有強致纖維化作用的轉化因子，可通過促進下游Smad3蛋白磷酸化，進而活化成纖維細胞，促使其合成膠原蛋白，增強纖維化，抑制TGF-β/Smad3信號，進而減輕CCl4誘導的肝纖維化[7，8]。在對骨肉瘤MG63細胞上皮-間質轉化的研究[9]中發現，鐮形棘豆總黃酮可抑制TGF-β/Smad3通路，因此推測鐮形棘豆總黃酮可能通過下調TGF-β/Smad3通路對乙肝大鼠發揮保護作用。2018年10月9日～2019年9月30日，本研究通過建立乙肝大鼠模型，觀察鐮形棘豆總黃酮灌胃對乙肝大鼠肝損傷的改善作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 大鼠、試劑及儀器 SPF清潔級雄性SD大鼠(體質量200～240 g)購自杭州子源實驗動物科技有限公司。乙型肝炎病毒抗原(XY-KY-1476)購自上海烜雅生物科技有限公司；鐮形棘豆(產自青海)購自青海優潤堂商貿有限責任公司，其總黃酮成分(純度為26.58%)由上海友思生物技術有限公司提取分離；阿昔洛韋購自揚子江藥業；乙肝表面抗原(HBsAg)ELISA試劑盒、乙型肝炎E抗原(HBeAg)ELISA試劑盒購自上海冠導生物工程有限公司；兔源GAPDH一抗、兔源纖維連接蛋白(FN)一抗、兔源四型膠原(Col IV)一抗(ab6586)、兔源TGF-β一抗、兔源Smad3一抗、兔源p-Smad3一抗、羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。全自動生化分析儀(PUZS-300)購自上海帝博思生物科技有限公司；酶標儀(XElx800)購自美國Perkin Elmer公司；凝膠成像系統(IBright CL 1500)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 乙肝大鼠模型制備、分組、鐮形棘豆總黃酮給予方法 參照文獻[10]以生理鹽水將乙肝病毒稀釋為1×106/mL，以10 mL/kg的劑量尾靜脈注射SD大鼠，每周注射1次，連續注射3周，然后檢測大鼠血清中ALT、AST、HBsAg及HBeAg水平，若均出現明顯上升，表明模型建立成功。本研究共建模63只，成功60只，隨機分為模型組、鐮形棘豆總黃酮低劑量組、鐮形棘豆總黃酮中劑量組、鐮形棘豆總黃酮高劑量組、阿昔洛韋組，每組12只；另取12只大鼠尾靜脈注射等劑量生理鹽水，記為對照組。鐮形棘豆總黃酮低劑量組、鐮形棘豆總黃酮中劑量組、鐮形棘豆總黃酮高劑量組分別以70、140、280 mg/kg的鐮形棘豆總黃酮溶液[10]進行灌胃處理，阿昔洛韋組以0.2 mg/kg的阿昔洛韋溶液進行灌胃處理，對照組和模型組以等劑量生理鹽水灌胃處理。

1.3 各組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST檢測 各組大鼠灌胃24 h后，經尾靜脈取血3 mL，靜置15 min后離心收集上清，采用ELISA試劑盒檢測血清HBsAg、HBeAg水平，采用全自動生化分析儀測定大鼠血清ALT、AST水平，具體操作參照說明書進行。

1.4 各組大鼠肝組織病理形態觀察 尾靜脈取血后處死大鼠，解剖獲得肝組織，剪取約0.5 g儲存在-80 ℃冰箱中備用，剩余組織經生理鹽水漂洗干凈，置于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后以石蠟包埋，切片機常規病理切片，脫蠟后置于梯度乙醇中浸泡處理，使用HE試劑盒進行染色，生理鹽水漂洗1次，再次經脫水、透明后封片，使用光學顯微鏡觀察肝組織病理形態。

1.5 各組大鼠肝組織纖維化相關蛋白及TGF-β/Smad3通路相關蛋白檢測 取大鼠肝組織，剪碎后置于含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液中，在冰浴中勻漿制備為勻漿液，4℃離心后取上清液，獲得總蛋白樣品液，BCA試劑盒測定各組樣品總蛋白濃度，取含相同質量總蛋白的樣品液上樣，進行電泳，分離蛋白，然后濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，根據目的蛋白分子量截取條帶，置于1∶1 000的兔源GAPDH、FN、Col IV、TGF-β、Smad3、p-Smad3一抗溶液中4℃孵育過夜，經TBST漂洗3次后，以1:2 000的羊抗兔二抗溶液室溫孵育2 h，再次經TBST漂洗3次后，使用增強化學發光法顯色，最后以凝膠成像系統觀察蛋白條帶并拍照，以Quantity One軟件分析圖片，得到各目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平比較 ①模型組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平分別為(4 127.26±210.81)IU/mL、(53.72±10.12)IU/mL、(95.21±12.01)U/L、(83.79±11.13)U/L，對照組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平分別為(2 976.32±130.62)IU/mL、(21.16±5.11)IU/mL、(46.17±8.63)U/L、(48.96±7.01)U/L，兩組相比，P均<0.05。②各組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平比較見表1。由表1可知，與模型組相比，鐮形棘豆總黃酮低劑量組、鐮形棘豆總黃酮中劑量組、鐮形棘豆總黃酮高劑量組、阿昔洛韋組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平均降低(P均<0.05)，且鐮形棘豆總黃酮各劑量之間有劑量依賴性(P均<0.05)，鐮形棘豆總黃酮高劑量組與阿昔洛韋組差異無統計學意義(P均>0.05)。

表1 各組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平比較

2.2 各組大鼠肝組織病理形態比較 對照組大鼠肝組織結構完整清晰，無病理損傷；模型組大鼠肝組織出現肝小葉結構紊亂，肝細胞變性壞死，數量減少，肝組織局部壞死，有炎性細胞浸潤及纖維結締組織增生等病理損傷；與模型組相比，鐮形棘豆總黃酮低劑量組、鐮形棘豆總黃酮中劑量組、鐮形棘豆總黃酮高劑量組、阿昔洛韋組大鼠肝組織上述病理損傷減輕，且鐮形棘豆總黃酮各組隨劑量升高而減輕程度增強，鐮形棘豆總黃酮高劑量組與阿昔洛韋組相比，肝組織上述病理損傷減輕程度無明顯差異。

2.3 各組大鼠肝組織FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量比較 ①模型組大鼠肝組織FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量分別為1.35±0.23、1.03±0.17、2.12±0.48、0.83±0.12，對照組大鼠肝組織FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量分別為0.13±0.04、0.07±0.02、0.12±0.02、0.06±0.01，兩組相比，P均<0.05。②各組大鼠肝組織FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量比較見表2。由表2可知，與模型組相比，鐮形棘豆總黃酮低劑量組、鐮形棘豆總黃酮中劑量組、鐮形棘豆總黃酮高劑量組、阿昔洛韋組大鼠肝組織FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量均降低(P均<0.05)，且鐮形棘豆總黃酮各劑量之間有劑量依賴性(P均<0.05)，鐮形棘豆總黃酮高劑量組與阿昔洛韋組差異無統計學意義(P均>0.05)。

表2 各組大鼠肝組織FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量比較

3 討論

乙肝作為一種傳染性疾病，近年來其發病率一直高于其他類型肝炎，是臨床研究的熱點，具有重大的社會意義[13]。患者感染乙型肝炎病毒后，病毒在體內的復制可引發機體免疫炎癥反應，損傷肝細胞，使反映肝功能損傷的指標血清ALT、AST水平升高，并誘導促纖維化因子TGF-β1表達，進而促使成纖維細胞活化、增殖，使肝組織中FN和Col IV蛋白大量合成，造成細胞外基質的沉積，最終導致肝組織炎癥損傷及肝纖維化[14]。本研究以乙肝病毒抗原對大鼠進行尾靜脈注射，建立乙肝大鼠模型，結果顯示，建模大鼠肝組織出現肝小葉結構紊亂、肝細胞變性壞死、數量減少、肝組織局部壞死、有炎性細胞浸潤及纖維結締組織增生等病理損傷，血清ALT、AST、HBsAg、HBeAg水平及肝組織FN、Col IV蛋白相對表達量明顯升高，表明乙肝病毒抗原可引起大鼠免疫應答，造成肝組織炎癥損傷，誘導肝纖維化，損害肝功能，提示模型建立成功。

乙型肝炎病毒引發的肝臟炎癥及氧化應激反應是導致肝組織損傷及纖維化的主要病理基礎，因而，抗炎、抗氧化是乙肝的有效治療手段。研究[14]顯示，鐮形棘豆總黃酮可降低胰島素抵抗細胞炎癥因子表達，減輕炎癥，抑制D-半乳糖誘導的急性衰老小鼠肝內氧化應激，延緩TGF-β1引發的人腎小管上皮細胞纖維化[6]，表明鐮形棘豆總黃酮具有抗炎、抗氧化及抗纖維化作用。但其對乙肝大鼠是否具有保護作用，目前還未見研究。本研究以鐮形棘豆總黃酮處理乙肝大鼠，結果顯示，大鼠肝組織病理損傷減輕，血清ALT、AST、HBsAg、HBeAg水平及肝組織FN、Col IV蛋白表達降低，且鐮形棘豆總黃酮各劑量之間呈劑量依賴性，表明鐮形棘豆總黃酮可減輕乙肝病毒感染，緩解炎癥損傷，降低纖維化相關蛋白表達，抑制肝纖維化，修復肝功能。

TGF-β/Smad3是調控細胞及組織纖維化的關鍵信號，上調其表達，可活化成纖維細胞，促進其增殖，導致細胞外基質的沉積，進而增強纖維化，抑制TGF-β/Smad3信號激活，降低Smad3的磷酸化水平，可減弱肝星狀細胞的活化，緩解TGF-β1誘導的肝纖維化，因而TGF-β/Smad3信號是乙肝的潛在治療靶點。本研究研究結果顯示，TGF-β/Smad3通路在乙肝大鼠體內處于激活狀態，而乙肝大鼠經鐮形棘豆總黃酮治療后，其肝組織TGF-β表達增強，Smad3蛋白磷酸化水平升高，臨床癥狀得到改善，表明鐮形棘豆總黃酮可能通過下調TGF-β/Smad3通路表達，進而減輕乙肝病毒感染，緩解肝內炎癥損傷及纖維化，增強肝功能。

綜上所述，鐮形棘豆總黃酮可能通過下調TGF-β/Smad3通路蛋白表達，緩解大鼠乙肝病毒的感染，減輕肝內炎癥及肝組織損傷，延緩肝纖維化，促進肝功能恢復，對乙肝大鼠具有一定保護作用。但本研究未以該通路抑制劑和激動劑進行對照驗證，且對其上下游信號分子也未進行充分探討，后期將深入進行相關研究。