白藜蘆醇對鈦顆粒誘導小鼠巨噬細胞形成的破骨細胞數量及F-actin環面積影響觀察

劉子歌,宋國瑞,張晨,李燕,劉心蕊,陳德勝

1 寧夏醫科大學臨床醫學院，銀川750004；2 寧夏醫科大學基礎醫學院；3 生育力保持教育部重點實驗室/寧夏生殖與遺傳重點實驗室；4 寧夏醫科大學總醫院

人工關節無菌性松動是人工全關節置換術后主要的長期并發癥之一，也是導致翻修手術最常見的原因[1]，而骨溶解是無菌性松動最突出的生物學表現。大量研究[2～4]表明，假體周圍的骨溶解是由假體部件之間的重復摩擦產生的磨損顆粒被巨噬細胞吞噬所導致的炎癥引起的。磨損顆粒激活的巨噬細胞可分泌多種促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、前列腺素E2等，由此引起的炎癥反應被認為是假體周圍骨溶解及隨后發生的無菌性松動的主要原因，即所謂的“顆粒病”，進而需要進行二次翻修手術，這也是導致植入物失敗的主要原因之一。研究[5]顯示，TNF-α、IL-1β等炎癥因子會引起炎性骨吸收，抑制骨形成，最終導致骨溶解和無菌性松動。白藜蘆醇是一種多酚，存在于葡萄、漿果和花生等多種飲食來源物中，有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種功能。有研究[6]證明，白藜蘆醇能夠促進成骨細胞的形成和功能，抑制破骨細胞的生成。研究[7]發現，白藜蘆醇對軟骨細胞有保護作用，可以延緩骨關節炎退變。在此基礎上，我們推測白藜蘆醇可以抑制假體磨損顆粒引起的假體周圍骨溶解和無菌性松動。為了驗證這一假設，2018年10月～2019年12月，我們觀察了白藜蘆醇對磨損顆粒誘導的體外破骨細胞生成及功能的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 白藜蘆醇、鈦顆粒、細胞及試劑 白藜蘆醇(C14H12O3，純度≥99.5%)購自美國MCE公司，商品純化鈦顆粒購自美國Alfa Aesar公司，小鼠巨噬細胞株RAW264.7購自中國科學院上海細胞庫，DMEM高糖培養基、胎牛血清購自美國Gbico公司，TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒購自北京博奧森生物技術公司，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒購自美國Sigma公司，內毒素檢測鱟試劑盒購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，CCK-8試劑盒購自江蘇凱基生物技術公司，Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉錄試劑盒、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa生物公司，β-actin、p-p65、p-IκBα抗體購自美國Cell Signalling公司，鬼筆環鈦染色試劑購自武漢塞維爾公司，熒光顯微鏡、IX71光學顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.2 實驗材料處理及濃度確定

1.2.1 鈦顆粒去除內毒素 將鈦顆粒在180 ℃條件下焙烤6 h，加入75%乙醇，水平搖床晃動48 h，離心后收集鈦顆粒并加入PBS并進行高溫高壓再次滅菌，PBS重懸，采用鱟試劑盒進行內毒素檢測，確保鈦顆粒內毒素含量低于0.1 EU/mL，方可用于細胞實驗。用于實驗的鈦顆粒終質量濃度為0.1 mg/mL[8]。

1.2.2 白藜蘆醇細胞毒性檢測及實驗濃度的確定 采用CCK-8細胞增殖實驗。將RAW264.7細胞以5×103/孔接種于96孔板，加入不同濃度(0、1、5、10、15、20、30 μmol/L)白藜蘆醇干預后，繼續培養72 h，加入10 μL CCK-8溶液，使用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值，計算細胞增殖活性。CCK-8細胞增殖實驗結果顯示，加入0、1、5、10、15、20、30 μmol/L白藜蘆醇后細胞增殖活性分別為1.000、1.020±0.009、1.029±0.011、1.010±0.008、0.979±0.009、0.957±0.009、0.870±0.022，其中加入1、5、10、15 μmol/L白藜蘆醇的細胞增殖活性與加入0 μmol/L白藜蘆醇的細胞增殖活性相比，P均>0.05。本研究選擇≤15 μmol/L的白藜蘆醇用于后續實驗。

1.3 細胞培養及分組 將RAW264.7細胞種于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，在5%CO2、37 ℃細胞培養箱培養。將RAW264.7細胞分為Sham組、Vehicle組、Low-Res組、Mid-Res組、High-Res組，后續試驗處理時，Sham組加入完全培養基，Vehicle組加入鈦顆粒(0.1 mg/mL)+完全培養基，Low-Res組加入鈦顆粒(0.1 mg/mL)+完全培養基+白藜蘆醇(1 μmol/L)，Mid-Res組加入鈦顆粒(0.1 mg/mL)+完全培養基+白藜蘆醇(10 μmol/L)，High-Res組加入鈦顆粒(0.1 mg/mL)+完全培養基+白藜蘆醇(15 μmol/L)。

1.4 各組破骨細胞數與F-actin環面積測算 ①采用TRAP染色法檢測各組破骨細胞數。取各組細胞以1×104/孔接種于6孔板，繼續培養5天后，4%多聚甲醛固定，加入TRAP染液，置入37 ℃生物培養箱中避光孵育1 h，堿性液沖洗干凈、晾干，按照Ping等[5]的方法，光鏡下觀察并計數破骨細胞數。②采用鬼筆環鈦染色法檢測各組破骨細胞F-actin環面積。取各組細胞以1×104/孔接種于6孔板，繼續培養5天后，加入4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100穿膜5 min，加入鬼筆環肽染色液在37 ℃生物培養箱中避光孵育2 h，DAPI室溫染色細胞核5 min，沖洗干凈，封片，按照Roscher等[9]的方法，熒光顯微鏡下觀察并測算F-actin環面積。

1.5 各組細胞中TNF-α、IL-1β mRNA和蛋白檢測 ①采用Realtime-PCR法檢測各組細胞中TNF-α、IL-1β mRNA。取各組細胞以1×104/孔/孔接種于6孔板，繼續培養5天后，TRIzol法提取總RNA，用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行Realtime-PCR反應。引物序列如下：TNF-α正向引物為5′-CCCTCACACTCAGATCATCTT-3′，反向引物為5′-CTGCTACGACGTGGGCTACAG-3′；IL-1β正向引物為5′-CCTCGTGCTGTCGGACCCATA-3′，反向引物為5′-CAGGCTTGTGCTCTGCTTGTGA-3′；β-actin正向引物為5′-AGGGTGTGATGGTGGGAATG-3′，反向引物為5′-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3′。以2-ΔΔCt表示細胞中目的mRNA的相對表達量。②采用ELISA法檢測各組細胞中TNF-α、IL-1β蛋白。取各組細胞以5×103/孔接種于96孔板，繼續培養5天后收集細胞培養上清，800 r/min離心5 min去除Ti顆粒和細胞，分別使用TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒檢測各組細胞上清液中炎性破骨因子TNF-α和IL-1β。

1.6 各組細胞p-p65、p-IκB蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細胞以1×104/孔接種于6孔板，繼續培養5天后，用細胞蛋白試劑盒提取各組細胞的蛋白，BCA法定量，配置12%分離膠溶液，常規SDS-PAGE電泳、轉膜，5%BSA封閉1 h后，分別加入p-p65(1∶1 000)、p-IκB(1∶1 500)和β-actin(1∶1 000)一抗4 ℃封閉過夜，加入二抗(1∶10 000)后用TBST稀釋，室溫孵育2 h，凝膠成像儀曝光，用Image J軟件進行灰度值分析，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組破骨細胞數與F-actin環面積比較 ①Vehicle組可觀察到較多體積較大、酒紅色、內含多個細胞核的破骨細胞，而應用不同濃度白藜蘆醇干預后，破骨細胞數隨著藥物濃度的增加而減少。Sham組、Vehicle組、Low-Res組、Mid-Res組、High-Res組破骨細胞數分別為0、(145.31±7.87)個、(129.63±4.12)個、(85.51±3.65)個、(69.76±5.63)個，其中Vehicle組和Low-Res組破骨細胞數相比，P>0.05，其余組間相比，P均<0.05。②Vehicle組可觀察到少量較大且呈綠色的F-actin環,內含多核細胞，細胞核被DAPI染呈藍色，細胞膜可見些許偽足，其中Low-Res組、Mid-Res組的F-actin環較Vehicle組略有減少，且細胞核減少，High-Res組多核細胞明顯減少。Sham組、Vehicle組、Low-Res組、Mid-Res組、High-Res組F-actin環面積分別為0、(3 642.31±987.01)μm2、(3 265.75±871.98)μm2、(2 497.45±712.61)μm2和(1 741.81±716.07)μm2，組間相比，P均<0.05。

2.2 各組細胞中TNF-α、IL-1β mRNA和蛋白相對表達量比較 各組細胞中TNF-α、IL-1β mRNA和蛋白相對表達量比較見表1。

表1 各組細胞中TNF-α、IL-1β mRNA和蛋白相對表達量比較

2.3 各組細胞中p-p65、p-IκB蛋白相對表達量比較 各組細胞中p-p65、p-IκB蛋白相對表達量比較見表2。

表2 各組細胞中p-p65、p-IκB蛋白相對表達量比較

3 討論

骨溶解的特征是磨損顆粒誘導的炎癥反應的激活，從而導致體內骨吸收與骨形成穩態的失調。研究[10]表明，破骨細胞的過度活動和骨吸收均與骨溶解密切相關。雖然許多細胞以各種方式參與這些病理過程，但破骨細胞是導致嚴重骨丟失并最終使假體松動的惟一骨降解細胞。一般來說，不同類型的磨損顆粒會從假體接觸摩擦面產生，在人工關節中主要是金屬碎片或超高分子量聚乙烯顆粒，它們會招募包括巨噬細胞和T淋巴細胞在內的免疫細胞到骨-種植體界面，觸發一系列促炎細胞因子的釋放，進而促進周圍其他細胞如成纖維細胞和成骨細胞產生更多細胞因子，加速假體周圍炎性微環境的形成[11]。在這些炎癥介質中，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)在破骨細胞的激活中起著至關重要的作用。M-CSF維持單核/巨噬細胞的生長，引導單核/巨噬細胞分化為破骨細胞前體細胞，而RANKL結合到破骨細胞前體細胞表面核因子κB受體活化因子(RANK)后，激活下游信號通路，主要涉及NF-κB信號傳導通路，最終導致成熟的破骨細胞分化和隨后的骨吸收活動。基于這些理論，我們認為通過破骨細胞的主要信號通路來靶向破骨細胞的形成是治療骨溶解的一種有效可行的方法。

白藜蘆醇是一種在多種植物中發現的非黃酮類多酚化合物。最近的研究[6，12]證明，白藜蘆醇具有多種健康益處，例如心血管疾病和癌癥的預防。然而，這些保護機制還沒有得到充分的探索。有研究[13，14]指出，其保護作用的可能機制之一是通過下調炎癥反應，包括抑制促炎介質的合成和釋放、修飾二十烷類化合物的合成、抑制一些活化的免疫細胞或環氧合酶1和2，降低促炎介質的合成。在本研究中，我們采用了磨損顆粒誘導下的體外破骨細胞形成模型來證明白藜蘆醇在骨溶解中的作用。為排除白藜蘆醇是通過對RAW264.7細胞產生毒性作用來影響破骨細胞形成的可能性。我們首先用不同濃度的白藜蘆醇對RAW264.7細胞干預72小時檢測各組的增殖活性，以評估白藜蘆醇的細胞毒性水平,結果顯示濃度≤15 μmol/L的白藜蘆醇對RAW264.7細胞的增殖是沒有影響的。TRAP是破骨細胞特異性的標志酶，TRAP染色是鑒定破骨細胞分化成熟的金標準，如果觀察到三個或以上細胞核同時TRAP呈現陽性(酒紅色)的細胞便可鑒定為是破骨細胞[15]。我們通過TRAP染色實驗觀察不同濃度的白藜蘆醇對RAW264.7細胞向破骨細胞分化的影響，我們發現，應用不同濃度白藜蘆醇干預后，染色呈陽性的破骨細胞數目隨著藥物濃度的增加而減少，且白藜蘆醇呈濃度趨勢抑制體外破骨細胞的成熟。此外，特征性F-actin環的形成是破骨細胞發揮骨吸收功能的前提條件，F-actin環錨定在礦化的基質上，可以形成一個密閉的骨吸收腔，破骨細胞依靠其行使骨吸收功能[16]。因此，我們進行鬼筆環肽染色以測試白藜蘆醇對F-actin環形成的影響，結果與TRAP染色結果相符，我們在Vehicle組可以清楚的觀察到大且清晰的F-actin環，然而用白藜蘆醇干預后，F-actin環的大小隨濃度而減少。結合TRAP的結果，我們認為白藜蘆醇在體外可以抑制破骨細胞的功能與成熟，并且與白藜蘆醇的濃度有關。

炎性骨溶解所誘導的炎性反應主要是通過磨損顆粒自身刺激巨噬細胞、成纖維細胞、成骨細胞及T淋巴細胞等分泌大量的TNF-α、IL-1β和IL-6炎性因子引起[17]。我們用ELISA法檢測了各組細胞上清液中TNF-α和IL-1β的分泌量，結果顯示白藜蘆醇能夠顯著抑制上述炎癥因子的表達，進一步證實了白藜蘆醇良好的抗炎效果。同時，本研究Realtime-PCR結果表明，白藜蘆醇可顯著降低TNF-α和IL-1β mRNA的表達，并呈濃度依賴性，這也進一步驗證了我們ELISA的檢測結果。我們最后檢測了白藜蘆醇處理后IκBα和p65磷酸化蛋白的表達。IκBα作為IκB家族中最重要的成員之一，它調控的是NF-κB這一細胞通路中關于機體免疫與炎癥的途徑，其與p65/p50二聚體結合，抑制其活性[18]。本研究結果顯示，通過影響IκBα和NF-κBp65的磷酸化，白藜蘆醇抑制了鈦顆粒誘導的小鼠RAW264.7巨噬細胞中NF-κB通路的活化。

綜上所述，白藜蘆醇呈濃度依賴性對鈦顆粒誘導小鼠巨噬細胞株RAW264.7形成的破骨細胞數量及F-actin環面積產生抑制作用，其抑制作用的機制與NF-κB信號通路有關。這說明，白藜蘆醇可能是治療假體磨損顆粒引起的骨溶解的一種潛在選擇的治療藥物。