轉染Survivin shRNA的皮膚鱗狀細胞癌細胞系凋亡、增殖及NF-κB信號通路相關蛋白表達觀察

譚亞琦，徐文俊，何焱玲

1 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院，北京100020；2 北京電力醫院

皮膚鱗狀細胞癌(cSCC)是非黑色素瘤皮膚癌第二常見的皮膚癌，占全世界所有皮膚癌的20%以上[1]。近年來，由于人口老齡化和紫外線暴露增加，cSCC的發病率在不斷的增加[2]。雖然cSCC的治療手段在不斷的提高，但是仍然達不到理想的療效，并且許多藥物有嚴重的不良反應，從而限制了持續的臨床反應，導致cSCC患者的預后較差，需要研究新的治療方法和策略[3]。Survivin是凋亡蛋白家族(IAP)重要成員之一，也是重要的促腫瘤基因。研究[4，5]報道，在卵巢癌和胰腺導管腺癌等惡性腫瘤組織中Survivin表達上調，可促進腫瘤的惡性進展。Survivin編碼的蛋白質參與多種細胞信號途徑的調控，因此Survivin在細胞分裂和細胞凋亡等生理過程和腫瘤細胞侵襲、轉移等病理過程中均發揮重要作用，可作為抗腫瘤治療的靶點[6]。研究[7]顯示，Survivin在cSCC干細胞樣細胞中高表達，沉默Survivin可降低角質形成細胞的惡性生物學行為，提示Survivin可能在cSCC發生發展中發揮重要作用。2018年2月～2019年12月，本研究觀察了轉染Survivin shRNA的cSCC細胞系凋亡、增殖及NF-κB信號通路相關蛋白的表達變化，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、轉染物及試劑 cSCC細胞系A431、Colo-16、SCL-1購自美國ATCC細胞庫，永生化正常皮膚角質細胞HaCat購自中國上海細胞庫。Survivin shRNA(通過小干擾RNA技術抑制Survivin基因表達的小分子化合物)、NC shRNA(NC對照小干擾RNA)購自中國上海吉凱公司。基礎培養基、FBS和胰酶購自美國Gibco公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，Bestar 1st Strand cDNA合成試劑盒購自上海DBI Bioscience公司，Survivin、內參GAPDH引物購自中國上海生工有限公司，SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑購自日本TaKaRa公司，細胞凋亡檢測試劑盒和蛋白上樣緩沖液購自中國上海碧云天生物技術有限公司，MTS試劑購自美國Biovision公司，蛋白裂解液購自中國北京索萊寶公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化IκB激酶α/β(p-IKKα/β)、磷酸化p65(p-p65)一抗體和兔二抗購自美國Proteintech公司，BCA試劑盒和ECL化學發光試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2 cSCC細胞系A431、Colo-16、SCL-1和永生化正常皮膚角質細胞HaCat中Survivin mRNA檢測及細胞選擇 取cSCC細胞系A431、Colo-16、SCL-1和永生化正常皮膚角質細胞HaCat在含10%FBS培養基的37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞融合度達95%時，按照1∶3進行傳代，采用qRT-PCR法檢測細胞中的Survivin mRNA：采用TRIzol裂解法提取細胞中總RNA，采用Bestar 1st Strand cDNA合成試劑盒逆轉錄成cDNA，以cDNA作為模板，以GAPDH基因為內參，SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑盒進行PCR反應。PCR反應條件為95 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，進行40個循環。Survivin正向引物為5′-CCGACGTTGCCCCCTGC-3′,反向引物為5′-TCGATGGCACGGCGCAC-3′；GAPDH正向引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,反向引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。以2-ΔΔCt表示細胞中Survivin的相對表達量。結果顯示， A431、Colo-16、SCL-1、HaCat細胞中Survivin mRNA的相對表達量分別為9.18±0.62、3.72±0.50、7.41±0.60、1.00±0.00，其中A431、Colo-16、SCL-1細胞中Survivin mRNA的相對表達量高于HaCat細胞(P均<0.05)，且A431細胞中Survivin mRNA的相對表達量最高。選取Survivin mRNA的相對表達量最高的A431細胞用于后續實驗。

1.3 A431細胞分組及轉染 將A431細胞分為sh-Survivin組和sh-NC組。取兩組細胞，胰酶消化后以1×105個細胞鋪至6孔板中，待細胞貼壁后，sh-Survivin組細胞采用脂質體2000轉染Survivin shRNA，sh-NC組細胞采用脂質體2000轉染NC shRNA，兩組細胞轉染后放至培養箱中培養48 h后，采用qRT-PCR法檢測各組細胞中Survivin mRNA。結果顯示，sh-Survivin組、sh-NC組細胞中Survivin mRNA的相對表達量分別為0.32±0.04、1.00±0.01，兩組相比，P<0.05，提示Survivin shRNA成功轉染A431細胞，并抑制Survivin mRNA的表達。

1.4 兩組細胞凋亡率測算 采用細胞周期實驗。取兩組細胞，常規轉染48 h后，PBS洗3次，加入4 ℃的無水乙醇固定細胞2 h，PBS洗2次，按照細胞凋亡試劑盒說明書加入染色緩沖液500 μL、Annexin V-FITC和PI各5 μL，常溫避光孵育15 min，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.5 兩組細胞增殖能力觀察 采用MTS法。取兩組細胞以每孔1 500個接種于96孔板中，轉染后放至細胞培養箱中培養，在第1、2、3、4 d時，分別加入20 μL的MTS試劑，放置培養箱中避光2 h后，使用全波長掃描儀檢測各孔在波長490 nm處的OD值，以OD值表示細胞增殖能力。

1.6 兩組細胞IκBα、p-IKKα/β、p-p65蛋白檢測 采用Western Blotting法。取兩組細胞，轉染48 h后收集細胞，PBS洗3次，加入蛋白裂解液，14 000 r/min離心30 min，取離心后的上清液，BCA試劑盒測得蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液于沸水中煮沸變性，SDS-PAGE凝膠電泳80 V分離蛋白2 h，350 mA電濕轉至PVDF膜2 h，5%BSA室溫孵育PVDF膜1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，以GAPDH為內參，ECL化學發光液、顯影液和定影液曝光蛋白條帶，采用Image J軟件檢測蛋白灰度值。目的蛋白相對表達量為目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

2 結果

2.1 兩組細胞凋亡率比較 sh-Survivin組、sh-NC組細胞凋亡率分別為19.21%±2.54%、4.52%±0.31%，兩組相比，P<0.05。

2.2 兩組細胞增殖能力比較 sh-Survivin組細胞第1、2、3、4 d時的OD值分別為0.27±0.01、0.32±0.04、0.37±0.03、0.54±0.08，sh-NC組分別為0.27±0.02、0.38±0.03、0.67±0.05和0.88±0.07，其中sh-Survivin組細胞第3、4 d時的OD值顯著低于sh-NC組(P均<0.05)。

2.3 兩組細胞IκBα、p-IKKα/β、p-p65蛋白相對表達量比較 sh-Survivin組中IκBα、p-IKKα/β、p-p65蛋白的相對表達量分別為0.61±0.11、0.13±0.06、0.09±0.05，sh-NC組分別為0.11±0.04、0.76±0.15、0.81±0.19，兩組相比，P均<0.05。

3 討論

cSCC是一種常見的惡性皮膚癌，起源于表皮上層中分化的角質形成細胞，對患者的生命和生存質量有很大的影響。盡管大多數早期cSCC患者可以通過手術切除成功治療，但由于cSCC具有高侵襲性和轉移性，尤其是淋巴結轉移性高，cSCC顯示出無法控制的生長，手術切除受到限制，只能選擇化學治療和放射治療。研究[8]顯示，cSCC對放射治療敏感，放療已經應用于完全淋巴結切除術后或不完全切除術后的輔助治療，但是伴隨淋巴結轉移的患者對放射治療不敏感。此外，cSCC具有高復發率，復發和轉移是cSCC患者死亡與復發的主要原因[9]。紫外線、化學致癌物、病毒感染和免疫抑制劑等是cSCC患者發病的高危因素，尤其是紫外線輻射，它通過產生活性氧損害皮膚[10]。但是cSCC的發病機制仍未闡明，基因的改變已經證實與腫瘤的發生發展密切相關[11，12]，因此在分子水平探索與cSCC發病機制相關的基因是尋找新治療靶點的重要途徑。

Roberta等[7]研究報道，Survivin是角質形成干細胞的重要標記物，并維持腫瘤的發展、侵襲和復發，Survivin表達減少可抑制cSCC角質形成細胞的克隆和生長能力，并認為Survivin是cSCC發育的關鍵基因。Survivin在其它惡性腫瘤中報道為促癌基因。在卵巢癌和胰腺導管腺癌中，Survivin抑制細胞凋亡，并促進細胞生長[4，5]。研究[13]顯示，Survivin是重要的抗凋亡分子，其通過IAP重復結構域與胱天蛋白酶結合而對其活化具有抑制作用，發揮抗細胞凋亡和保護細胞生長的作用。此外，Survivin是染色體乘客復合物的組成部分，參與調節細胞生長重要過程-有絲分裂紡錘體的形成，即在有絲分裂過程中準確調節染色體的分離，促進細胞的生長[14]。因此，本研究觀察了Survivin對cSCC細胞凋亡和生長作用的影響。

本研究首先采用qRT-PCR法檢測Survivin在cSCC細胞系中的表達情況，結果顯示，與永生化正常皮膚角質細胞HaCat相比，Survivin在cSCC細胞系A431、Colo-16和SCL-1中的表達顯著增加，并選擇Survivin表達最高的cSCC細胞系A431進行Survivin shRNA的轉染，qRT-PCR驗證A431細胞中Survivin表達減少后，細胞周期實驗和MTS實驗發現Survivin shRNA促進A431細胞的凋亡和抑制A431細胞的生長能力，但其作用的分子機制仍需進一步探索。

Survivin是多種細胞信號的重要節點[5]，通過靶向Survivin，可能同時阻制了多種腫瘤信號通路。Sim等[15]報道，Survivin的一種小分子抑制劑YM155可以抑制腎透明細胞癌中NF-κB信號通路，即減少p65磷酸化表達水平，并減弱了p65/p50異二聚體的轉錄能力。NF-κB信號通路介導腫瘤的凋亡和生長能力[16]，在cSCC中處于異常激活狀態[17]，p65和p50以異型二聚體的形式構成NF-κB，在細胞質中NF-κB與IκBα結合，處于抑制狀態，IκBα可被p-IKKα/β通過泛素化途徑降解，使得NF-κB處于游離狀態，同時p-IKKα/β可以磷酸化p65，最終導致NF-κB信號通路被激活[18]。本研究采用Western Blotting法檢測發現Survivin shRNA抑制p-IKKα/β和p-p65蛋白的表達，促進IκBα蛋白的表達，表明Survivin shRNA可能通過抑制NF-κB信號通路促進cSCC細胞的凋亡和降低細胞的生長能力。

綜上所述，干擾Survivin可促進cSCC細胞凋亡、抑制cSCC細胞增殖，其作用機制可能與抑制NF-κB信號通路的激活有關。Survivin可能是cSCC患者治療的潛在靶點。