重組促紅細胞生成素對脂肪肝缺血再灌注損傷大鼠細胞凋亡和炎癥因子的影響

常順伍，韓曉玉，宮曉光，王葆春

海南省人民醫院普通外科，海南 海口 570311

肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)是指肝臟組織缺血一段時間后重新恢復血流，但損傷卻進一步加重的現象[1]。HIRI是肝臟外科手術常見的病理過程，同時也是導致肝部分切除術和肝移植術術后肝功能衰竭的主要原因，減輕術中HIRI有助于降低手術對肝功能的影響[2]。促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種酸性糖蛋白，EPO通過調節紅細胞生成從而增加組織供氧，對缺血再灌注器官的保護作用，但存在感染、輸血反應等潛在危險[3]。重組促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)是利用人工基因技術將EPO基因轉入哺乳動物細胞內而得，研究證實rHuEPO對大鼠腦缺血再灌注損傷后血腦屏障內皮屏障抗原及通透性具有良好的保護作用[4-5]，可降低炎癥反應及細胞黏附分子-1表達，但關于rHuEPO對HIRI大鼠細胞凋亡和炎癥因子影響的研究較少，因此本文就此問題展開研究，以期為臨床上HIRI的防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 高脂飼料飼養的無特定病原體(specific pathogen free，SPF)雄性SD大鼠90只，購于廣東省醫學實驗動物中心，體質量250～300 g，飼養溫度20℃～25℃，濕度45%～60%，室內風速0.1～0.2 m/s，采用隨機數表法分為假手術組、模型組和rHuEPO組，每組30只。

1.2 方法

1.2.1 建模與干預 所有大鼠建模前禁食12 h，自由飲水，腹腔注射10%的水合氯醛400 mg/kg麻醉，仰臥位固定，常規腹部脫毛并消毒，經陰莖背靜脈注射稀釋肝素(南京新百藥業有限公司，國藥準字H32026497，規格2 mL：5 000 U)400 mg/kg，取上腹正中切口入腹后進一步操作。假手術組：僅解剖分離肝十二指腸韌帶，不阻斷肝組織血流；模型組和rHuEPO：采用無創血管夾夾閉阻斷肝中葉及左肝葉建立大鼠45%減體積HIRI模型，缺血時間45 min。干預方法：rHuEPO組于缺血前24 h時腹腔注射rHuEPO(哈藥集團生物工程有限公司，國藥準字S20050090，規格3 000 IU/瓶)4 000 IU/kg，假手術組和模型組于缺血前24 h腹腔注射等容量的生理鹽水。

1.2.2 血液及肝組織標本采集 各組大鼠均隨機分為再灌注后1 h、3 h和6 h三個亞組，每個亞組10只，均采集下腔靜脈血3 mL，在2 500 r/min下離心10 min，離心半徑6 cm，常規分離血清與血漿，留取血清、血漿保存于-20℃冰箱待測。所有大鼠在采血后處死，統一取左肝葉肝組織標本待測。

1.3 觀察指標與檢測方法

1.3.1 肝細胞凋亡情況 肝組織標本置于4%的多聚甲醛中24 h后常規石蠟包埋切片，切片經二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水處理后，采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTPnick end labeling，TUNEL)標記肝組織凋亡細胞，在光學顯微鏡下觀察，正常細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈棕黃色，計數5個高倍視野(400倍)下細胞凋亡情況，細胞凋亡率=凋亡細胞數/視野下細胞總數×100%，計算平均每100個細胞中的凋亡細胞數，并以百分數表示作為凋亡指數。

1.3.2 肝組織病理形態學觀察 肝組織切片后蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察肝組織結構；切片取新鮮左葉肝組織約1 mm3，采用戊二醛(濃度2.5%)固定，1%的鋨酸后固定，梯度乙醇脫水處理，環氧樹脂包埋超薄切片，在JEM-100CX透射電鏡(日本JEOL公司)下觀察肝組織超微結構改變情況。

1.3.3 肝功能檢測 采用日立7600系列全自動生化儀測定各亞組血清中丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。

1.3.4 炎癥因子檢測 采用試劑盒檢測各亞組血漿腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)，TNF-α檢測試劑盒構圖上海晶抗生物工程有限公司，LI-1檢測試劑盒購于北京方程佰金科技有限公司，檢測中嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.3.5 氧化應激檢測 采用黃嘌呤氧化酶法測定肝組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平，采用硫代巴比妥酸法測定肝組織丙二醛(malonaldehyde，MDA)水平。

1.4 統計學方法 數據資料均采用SPSS22.0進行統計學分析，肝細胞凋亡指數、ALT、AST、TNF-α、IL-1、SOD及MDA等計量資料均符合正態分布，采用均數±標準差(x-±s)描述，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，三組比較、同組內不同亞組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝細胞凋亡指數比較 模型組肝細胞凋亡指數高于rHuEPO組和假手術組，rHuEPO組高于假手術組，差異有統計學意義(P＞0.05)；隨著再灌注時間的推移，模型組和rHuEPO組細胞凋亡指數均顯著增高，再灌注3 h組高于再灌注1 h組，再灌注6 h組高于再灌注3 h組，差異有統計學意義(P＜0.05)；假手術組的不同亞組細胞凋亡指數比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肝細胞凋亡指數比較(±s，%)

表1 各組大鼠肝細胞凋亡指數比較(±s，%)

注：與再灌注1 h比較，a P＜0.05；與再灌注3 h比較，b P＜0.05；與假手術組比較，c P＜0.05；與模型組比較，d P＜0.05。

假手術組模型組rHuEPO組F值P值30 30 30 3.28±0.63 27.86±2.87c 21.38±2.62cd 15.782＜0.05 3.56±0.83 37.24±3.65ac 28.65±2.74acd 14.657＜0.05 3.41±0.72 46.92±3.88abc 32.44±3.07abcd 14.879＜0.05

2.2 各組大鼠肝組織細胞形態變化病理觀察 光鏡下觀察顯示：與假手術組比較，模型組、rHuEPO組肝小葉結構紊亂，肝細胞水腫明顯且伴有較多的空泡變性，可見間質充血水腫伴炎性細胞浸潤，肝血竇變窄等，部分肝組織中央靜脈有不同程度的淤血，模型組的情況較rHuEPO組更嚴重。電鏡下觀察顯示：模型組、rHuEPO組細胞核呈不規則鄒縮，核染色質明顯濃縮和向邊緣聚集，胞質中線粒體腫脹明顯，線粒體嵴和線粒體膜被破壞，內質網呈不規則密集團狀，小泡和高爾基體消失，模型組的情況較rHuEPO組更嚴重，見圖1。

2.3 各組大鼠肝功能指標比較 假手術組血清ALT、AST水平低于rHuEPO組和模型組，rHuEPO組低于模型組，差異有統計學意義(P＞0.05)；隨著再灌注時間的推移，模型組和rHuEPO組血清ALT、AST水平均顯著增高，再灌注3 h組高于再灌注1 h組，再灌注6 h組高于再灌注3 h組，差異有統計學意義(P＜0.05)；假手術組的不同亞組血清ALT、AST水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清ALT、AST水平比較(±s，U/L)

表2 各組大鼠血清ALT、AST水平比較(±s，U/L)

注：與再灌注1 h比較，a P＜0.05；與再灌注3 h比較，b P＜0.05；與假手術組比較，c P＜00.05；與模型組比較，d P＜0.05。

組別 只數ALT AST假手術組模型組rHuEPO組F值P值30 30 30再灌注1 h 137.23±24.76 493.27±57.83c 278.33±44.29cd 22.783＜0.05再灌注3 h 139.83±25.87 805.29±68.92ac 425.71±48.99acd 26.485＜0.05再灌注6 h 135.52±26.13 1185.44±82.59abc 621.57±55.76abcd 31.296＜0.05再灌注1 h 180.25±33.28 689.75±66.57c 392.54±41.36cd 27.414＜0.05再灌注3 h 175.16±34.27 987.36±89.49ac 502.78±49.63acd 31.085＜0.05再灌注6 h 178.26±34.82 1328.53±95.27abc 711.44±56.59abcd 33.496＜0.05

2.4 各組大鼠炎癥因子指標比較 假手術組血漿TNF-α、IL-1水平低于rHuEPO組和模型組，rHuEPO組低于模型組，差異有統計學意義(P＞0.05)；隨著再灌注時間的推移，模型組和rHuEPO組血漿TNF-α、IL-1水平均顯著增高，再灌注3 h組高于再灌注1 h組，再灌注6 h組高于再灌注3 h組，差異有統計學意義(P＜0.05)；假手術組的不同亞組血漿TNF-α、IL-1水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血漿TNF-α、IL-1水平比較(±s，ng/L)

表3 各組大鼠血漿TNF-α、IL-1水平比較(±s，ng/L)

注：與再灌注1 h比較，a P＜0.05；與再灌注3 h比較，b P＜0.05；與假手術組比較，c P＜0.05；與模型組比較，d P＜0.05。

組別 只數TNF-α IL-1假手術組模型組rHuEPO組F值P值30 30 30再灌注1 h 17.36±2.24 24.15±3.83c 19.28±2.76cd 6.572＜0.05再灌注3 h 21.59±2.36 185.47±22.38ac 104.29±17.68acd 24.279＜0.05再灌注6 h 20.33±2.13 297.56±41.57abc 198.36±31.22abcd 27.648＜0.05再灌注1 h 25.66±2.87 36.48±2.95c 30.17±3.05cd 8.472＜0.05再灌注3 h 26.82±2.91 202.57±28.53ac 126.39±20.63acd 26.574＜0.05再灌注6 h 27.05±2.89 392.64±44.52abc 201.85±26.47abcd 39.667＜0.05

2.5 各組大鼠氧化應激指標比較 假手術組肝組織SOD水平高于rHuEPO組和模型組，rHuEPO組高于模型組，差異有統計學意義(P＞0.05)；假手術組肝組織MDA水平低于模型度和rHuEPO組，rHuEPO組低于模型組，差異有統計學意義(P＞0.05)；隨著再灌注時間的推移，模型組和rHuEPO組組織SOD水平均顯著降低，MDA水平顯著升高，再灌注3 h組與再灌注1 h組比較，再灌注6 h組與再灌注3 h組比較差異有統計學意義(P＜0.05)；假手術組的不同亞組肝組織SOD、MDA水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表4。

表4 各組大鼠肝組織SOD、MDA水平比較(±s，U/mg)

表4 各組大鼠肝組織SOD、MDA水平比較(±s，U/mg)

注：與再灌注1 h比較，a P＜0.05；與再灌注3 h比較，b P＜0.05；與假手術組比較，c P＜0.05；與模型組比較，d P＜0.05。

組別 只數SOD MDA假手術組模型組rHuEPO組F值P值30 30 30再灌注1 h 113.28±9.67 51.25±6.34c 82.58±7.42cd 15.784＜0.05再灌注3 h 115.07±9.72 42.36±6.14ac 70.06±6.95acd 19.376＜0.05再灌注6 h 114.36±9.52 36.18±5.92abc 67.43±6.71abcd 21.494＜0.05再灌注1 h 5.12±0.67 14.81±2.23c 7.36±1.12cd 4.713 0.002再灌注3 h 4.83±0.61 21.36±1.85ac 14.39±1.39acd 9.782＜0.05再灌注6 h 4.80±0.44 28.46±1.49abc 20.51±1.83abcd 11.525＜0.05

3 討論

HIRI多見于需要阻斷肝臟血流的外科手術，其發生機制主要包括代謝性酸中毒、氧自由基增多、中性粒細胞表達上調、鈣超載、及細胞因子表達異常等[6-7]。一般情況下，HIRI是術后肝功能異常、原發性移植肝無功能、肝功能衰竭的重要原因。因此，如何有效預防HIRI是手術成功的關鍵環節之一。目前尚無治療HIRI的有效方法，有研究表明，通過再灌注前給藥及缺血預處理可不同程度減輕肝損傷程度[8-9]。脂肪肝對HIRI更敏感，術后發生肝功能衰竭的風險更大[10]。rHuEPO的主要成分是促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)，目前臨床上主要用于治療貧血，其刺激骨髓生成紅細胞以及對心肌、腦、腎臟缺血再灌注損傷的保護作用已被廣大學者的研究予證實[11-12]。rHuEPO對脂肪肝缺血再灌注損傷后肝細胞凋亡及炎癥因子的影響及機制目前尚不明確。

本研究顯示，相對于假手術組而言，模型組和rHuEPO組均存在肝細胞組織結構及肝細胞超微結構改變，而模型組改變情況較rHuEPO組更嚴重，說明HIRI后存在肝細胞組織結構改變，而rHuEPO預處理能一定程度抑制這種改變，從而發揮了保護肝功能的作用。模型組各亞組肝細胞凋亡指數高于rHuEPO組和假手術組相同時相的各亞組，說明HIRI后存在肝細胞凋亡情況，通過rHuEPO預處理能較大程度抑制肝細胞凋亡，可以作為提高脂肪肝手術安全性和改善預后的方案之一。ALT和AST是肝功能檢查的兩項常用指標，當肝臟受損時，可引起ALT和AST水平升高[13-14]。本研究顯示，假手術組各亞組血清ALT、AST水平低于rHuEPO組和模型組相同時相的各亞組，rHuEPO組各時相亞組均低于模型組相同時相的各亞組，說明HIRI后存在肝功能損傷，而通過rHuEPO預處理可一定程度上保護肝功能。rHuEPO對脂肪肝HIRI后肝功能的保護作用機制尚不清楚，有研究顯示，rHuEPO不能直接促進抗凋亡信號通路和誘導B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bul-2)信使RNA表達，rHuEPO對HIRI后肝臟的保護作用不是直接作用于肝細胞，可能通過其他機制發揮作用[15-16]。

過度炎癥反應是缺血再灌注后肝損傷的主要機制之一，抑制缺血再灌注過程中的炎癥反應可減輕肝臟損傷[17-18]。TNF-α、IL-1是兩種重要的炎癥因子，通過促進白細胞局部聚集與活化、誘導黏附分子及趨化因子表達等多種途徑介導炎癥反應，其表達水平上調可增大缺血再灌注損傷程度。本研究顯示，假手術組各亞組血漿TNF-α、IL-1水平低于rHuEPO組和模型組相同時相的各亞組，rHuEPO組各時相亞組均低于模型組相同時相的各亞組，說明HIRI后存在過度炎癥反應情況，rHuEPO預處理可一定程度抑制脂肪肝缺血再灌注過程中的炎癥反應。SOD是體內重要的氧化酶，肝臟缺血再灌注是其活性降低；MDA是機體脂質過氧化反應的主要產物，其水平反映了氧化應激損傷程度[19]。本研究顯示，假手術組各亞組肝組織SOD水平高于rHuEPO組和模型組相同時相的各亞組，rHuEPO組各亞組高于模型組相同時相的各亞組；假手術組各亞組肝組織MDA水平低于模型度和rHuEPO組相同時相的各亞組，rHuEPO組各亞組低于模型組相同時相的各亞組，肝臟缺血再灌注過程存在過度氧化應激反應，rHuEPO預處理可一定程度抑制氧化應激反應。

綜上所述，rHuEPO可能通過抑制大鼠脂肪肝缺血—灌注過程中的炎癥反應和氧化應激反應發揮對肝功能的保護作用，能一定程度抑制肝細胞凋亡。