第二代測序技術在五例人類皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎診斷中的應用

金珂 王曉娟 關鴻志 秦靈芝 賈亞珍 周珂珂 馬海暢 王月 王芳 邢麗 李瑋

人類皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎是指由皰疹病毒原發感染或潛伏感染再激活后引起的嚴重的中樞神經系統感染性疾病，好發于老年人、兒童或免疫力低下人群，具有發病率高、病死率高的特點，臨床主要表現為發熱、頭痛、嘔吐、精神行為異常、癲發作、共濟失調、頸項強直等，甚至可引起譫妄、昏迷、呼吸或循環衰竭［1-2］。目前，病毒分離與聚合酶鏈反應（PCR）是診斷該病的“金標準”，但病毒分離與鑒定耗時長且檢出率低，而PCR 則受引物所能結合的核酸片段的限制，從而大大地限制了這兩種實驗方法的臨床應用。而第二代測序技術（NGS）具有不受靶向引物限制、檢測速度快、檢出率高等特點，可以快捷并高效地輔助臨床診斷，自2014 年首次報道以來逐漸在臨床腦脊液標本病原體檢測中推廣應用［3］。筆者通過對5 例人類皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎患者臨床及腦脊液第二代測序結果的分析，擬評價該項技術在皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎診斷中的應用價值。

對象與方法

一、觀察對象

1.納入標準 （1）臨床特征符合腦膜炎或腦炎癥狀與體征（發熱、頭痛、精神狀態改變、癲發作、頸項強直等）。（2）腰椎穿刺腦脊液檢查白細胞計數＞5×106/L。（3）影像學檢查可見腦膜強化或腦實質異常改變。（4）腦脊液第二代測序檢出人類皰疹病毒序列。（5）臨床無其他微生物感染證據。（6）本研究經鄭州大學人民醫院倫理委員會批準［倫理批號：（2017）倫審第（35）號］，并為北京市腦炎協作組腦脊液第二代測序合作研究項目子項目（倫理批號：JS-890），入組病例及其家屬對研究內容知情并簽署知情同意書。

2.排除標準 （1）非感染性腦炎如自身免疫性腦炎（IE）、副腫瘤邊緣性腦炎（PLE）、視神經脊髓炎譜系疾?。∟MOSDs）、風濕免疫性疾病累及中樞神經系統。（2）近期（發病＜4 周）有疫苗接種史。（3）存在腰椎穿刺禁忌證或無法獲取腦脊液。

3.一般資料 選擇2018 年1-9 月在我院神經內科住院并確診的患者共5例，男性3例，女性2例；年齡 17 ～ 72 歲，平均為 40.20 歲。5 例患者均急性發病，病程為6 ～13 d，平均8 d；發病季節分別為夏季（例1、例2）、秋季（例3、例5）和冬季（例4）；既往病史包括肺腺癌腦轉移（例1）、高血壓（例2、例4）；癥狀與體征以發熱、頭痛、頸項強直（5 例）為主，同時可伴有精神行為異常（例1）、左上面部皰疹（例2）、嗜睡或癲發作（例1、例2和例5），詳見表1。

二、研究方法

1.腦脊液第二代測序 （1）標本采集：對入組患者行腰椎穿刺獲取1 ～2 ml 腦脊液，滴入試管（德國Sarstedt 公司），于30 min 內置-80 ℃冰箱保存，用于第二代測序。（2）樣本提取與質控：采用微量樣本基因組DNA 提取盒［DP316 型，天根生化科技（北京）有限公司］提取腦脊液樣本DNA，通過DNA 切割超聲破碎儀（Q800R2，美國Qsonica 公司）破碎至200 ～300 bp 小片段，2100 生物分析儀（美國Agilent 公司）質控片段大小，定量PCR（美國Thermo Fisher 公司）質控DNA 文庫濃度。（3）文庫構建：在獲得的DNA片段末端修復和加A后，在其兩端添加接頭序列，并將其環化形成單鏈環狀DNA，滾環擴增技術將單鏈環狀 DNA 增加 2 ～ 3 個數量集，獲得 DNA 納米球。（4）測序：將DNA 納米球加載至測序芯片上，使用BGISEQ-50 測序平臺（天津華大基因科技有限公司醫學檢驗所）對DNA納米球進行測序。

2.數據分析與質量控制 測序數據下機后，剔除低質量、低復雜度、測序長度＜35 bp的讀數，獲得高質量的測序數據后與BWA 人類基因組數據庫（http：//bio-bwa.sourceforge.net/）進行比對，然后剔除人類基因組序列信息的干擾，再將剩余數據與微生物數據庫（ftp：//ftp.nebi.nlm.nih.gov/genomes/）進行比對，達到對細菌、病毒、真菌及原生生物的初步鑒定。本研究是與北京協和醫院腦炎協作組的合作項目，針對臨床真陰性或腦脊液培養陽性的中樞神經系統感染患者進行研究，初步獲得常見背景菌信息，例如痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌等，當微生物初步鑒定完成后，再次剔除常見背景菌，獲得更為可靠的數據報告［4］。主要觀察指標為病毒種，以腦脊液第二代測序所檢測到的病毒序列數＞1 為條件進行鑒定。

結 果

血清學檢查，白細胞計數（6.08 ～13.94）×109/L［（3.50 ～ 9.50）× 109/L］，鈉離子133 ～ 143 mmmol/L（137 ～ 147 mmmol/L），細菌培養均呈陰性。5 例患者均于入院2周內行腦脊液檢查，腦脊液外觀清亮、透明，壓力為195 ～310 mm H2O（1 mm H2O=9.81×10-3kPa，80 ～ 180 mm H2O），白細胞計數為（74 ～260）× 106/L［（0 ～ 5）× 106/L］，單核細胞比例為85.30% ～ 100.00%（15% ～ 45%），蛋白定量 640 ～1620 mg/L（150 ～ 460 mg/L），葡萄糖水平為 2.24 ～3.23 mmol/L（2.50 ～ 4.50 mmol/L），氯化物 117.80 ～125.00 mmol/L（120 ～132 mmol/L）；腦脊液細菌培養無陽性病例（表2）。本組患者腦脊液新型隱球菌莢膜抗原、Xpert 耐藥結核桿菌、抗酸-真菌-革蘭染色和自身免疫性抗體檢測均呈陰性。MRI 檢查，2 例呈現軟腦膜強化（例3、例 4）；3 例T2WI 和FLAIR 成像表現為高信號影，其中1例（例1）定位于雙側額顳葉、1 例（例2）定位于雙側額葉，1 例（例5）定位于側腦室周邊及雙側枕葉（圖1）。

以腦脊液第二代測序所檢測到的病毒序列數＞1 為條件，共計分離與鑒定病毒 1 屬 3 種，1 例（例 1）檢出人類皰疹病毒Ⅰ型（HHV-1），臨床診斷為人類皰疹病毒Ⅰ型腦炎；3 例（例2、例3、例4）檢出人類皰疹病毒Ⅲ型（HHV-3），臨床診斷為人類皰疹病毒Ⅲ型腦炎和（或）腦膜炎；1例（例5）檢出人類皰疹病毒Ⅳ型（HHV-4），臨床診斷為人類皰疹病毒Ⅳ型腦炎。腦脊液第二代測序檢出人類皰疹病毒核酸序列數為 4 ～ 5406 條，平均為 2089.20 條，將鑒定的讀數映射至病毒基因組的覆蓋度為0.08%～81.01%，檢測深度為1.00 ～2.21（表3）。同時，還鑒定出細菌5屬12種，真菌4屬5種，未見原生生物（寄生蟲等）。

本組5 例患者均采取抗病毒治療，3 例（例1、例2、例 4）予更昔洛韋30 mg/次（2 次/d）治療，2 例（例3、例5）予阿昔洛韋15 mg/次（3次/d）口服，同時配合低劑量激素（甲潑尼龍50 mg/d）靜脈注射以減輕腦水腫，以及對癥支持治療，療程7 ～22 d。住院期間并發低鈉血癥者［2例（例1、例2）］予高鹽飲食；高同型半胱氨酸血癥（例3）和雙側胸腔積液（例5）者均未進行特殊治療，其中胸腔積液者在密切監測下液體自行吸收。經治療后，5 例患者頭痛、發熱、頸項強直等癥狀均消失，血液及腦脊液常規、生化指標明顯好轉，血常規白細胞計數（6.08 ～7.90）×109/L，腦脊液白細胞計數（34 ～70）×106/L、蛋白定量440 ～730 mg/L、葡萄糖 2.56 ～ 3.59 mmol/L、氯化物為119.80 ～ 124.80 mmol/L。1 個月后隨訪，5 例患者均無癥狀，各項實驗室指標恢復至正常值范圍。

討 論

人類皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎是人類中樞神經系統感染中最為常見的疾病之一，大多由人類皰疹病毒顆粒在原發感染位點或內皮細胞、周圍神經元、淋巴細胞、腎臟、分泌腺等位點潛伏或復制，并通過血行傳播、神經元回路擴散、醫原性途徑或其他機制通過血腦屏障進入中樞神經系統，好發于老年人、兒童或免疫力低下的人群［1，5-6］。臨床發病急驟、癥狀重，缺乏特異性，確診依賴實驗室檢查結果。但腦脊液樣本有限，僅能滿足部分檢查需要，且實驗室檢查耗時耗力、病原確診率低。腦脊液病毒分離與鑒定雖然被認為是診斷病毒性腦炎的“金標準”，但據文獻報道僅有＜5%的病例可以被成功鑒定［7-10］。PCR 技術雖然能夠提高腦脊液病原學診斷陽性率，但單次檢測范圍受限，只能檢測引物所能結合的病原體核酸片段，因此其臨床應用難以推廣。血清學診斷方面，病毒抗體檢測于病毒感染后2 ～4 周才能達到診斷陽性率的高峰，且檢測容易出現假陽性結果。因此，為了進一步提高病原檢出率，臨床迫切需要一種新的技術方法［11-13］。

圖1 頭部MRI檢查所見 1a 例1患者橫斷面抑脂FLAIR成像顯示雙側額顳葉高信號影，雙側顳葉呈現“刀背征”，丘腦及蒼白球可見散在類圓形高信號影（箭頭所示） 1b 例2 患者橫斷面抑脂FLAIR 成像顯示雙側額葉深部高信號影（箭頭所示） 1c，1d 例3 和例4 橫斷面增強T1WI 可見軟腦膜強化影增多 1e 例5 患者橫斷面抑脂FLAIR 成像顯示側腦室周圍及雙側枕葉高信號影（箭頭所示）Figure 1 Head MRI findings of 5 patients with human herpes virus encephalitis/meningitis Axial FLAIR imaging of Case 1 showed high-intensity signals in bilateral frontotemporal lobe and "knife back sign" in bilateral temporal lobe. In addtion, scattered round-like high-density signals could be seen in thalamus and globus pallidus (arrows indicate, Panel 1a). Axial FLAIR of Case 2 showed highintensity signals in bilateral frontal lobe (arrows indicate, Panel 1b). Axial enhanced T1WI of Case 3 and Case 4 showed increasing of leptomeningeal enhancement shadow (Panel 1c, 1d). Axial FLAIR of Case 5 showed high-intensity signals around the lateral ventricle and bilateral occipital lobe (arrows indicate, Panel 1e).

2015 年，中國醫學科學院北京協和醫院關鴻志教授對4例病毒性腦炎確診患者的腦脊液標本進行第二代測序，2 例檢出人類皰疹病毒Ⅰ型（測序深度分別為35、3.3，覆蓋度分別為98%、53%）、1 例檢出人類皰疹病毒Ⅱ型（HHV-2，測序深度為1.3，覆蓋度為27%）、1 例檢出人類皰疹病毒Ⅲ型（測序深度為1.1，覆蓋度 12%）［14］。隨后，Xing 等［10］應用腦脊液第二代測序技術確診人類皰疹病毒Ⅰ型腦炎6 例，人類皰疹病毒Ⅱ型腦炎1 例，人類皰疹病毒Ⅲ型腦炎 3 例。2019 年，Wilson 等［15］報告一項大樣本前瞻性臨床試驗結果，在204例特發性腦膜炎、腦炎或脊髓炎住院患者中，腦脊液第二代測序共檢出13例常規檢查方法無法確診的病例，其中8 例在行腦脊液第二代測序之前并未被考慮為中樞神經系統感染。上述研究表明，腦脊液第二代測序在人類皰疹病毒病原學診斷中具有一定臨床應用價值。

本組5例人類皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎患者的癥狀與體征均缺乏特異性，血清和腦脊液病原學檢查結果，以及自身免疫性腦炎抗體檢測均呈陰性，腦脊液白細胞計數為（74 ～260）×106/L，以淋巴細胞為主，蛋白定量略升高，葡萄糖輕度降低或正常，影像學可見病灶多集中于額葉、顳葉、枕葉、軟腦膜、側腦室周圍等部位，符合病毒性腦炎和（或）腦膜炎的臨床特征，但與其他種類病毒如腸道病毒所致腦炎和（或）腦膜炎，以及自身免疫性腦炎難以鑒別。本研究通過腦脊液第二代測序分析，1 例檢出人類皰疹病毒Ⅰ型、3 例檢出人類皰疹病毒Ⅲ型以及1例檢出人類皰疹病毒Ⅳ型；其中，人類皰疹病毒Ⅳ型是Epstein-Barr 病毒，主要侵犯B 淋巴細胞。本組5 例患者的人類皰疹病毒核酸序列數為4 ～5406條，平均2089.20條，覆蓋度為0.08%～81.01%，其中1例（例5）覆蓋度較低（＜1%），考慮可能與測序深度偏低有關，例如背景信息的干擾、腦脊液病毒載量較少，或者從發病至獲取腦脊液樣本時間過長而致病毒核酸降解等。5 例患者經過抗病毒治療后病情均明顯改善，支持病毒性腦炎和（或）腦膜炎的診斷。

表3 5例人類皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎患者第二代測序結果Table 3. NGS results of 5 patients with human herpesvirus encephalitis/meningitis

本研究樣本量較小，而且測序深度偏低、基因覆蓋度低，有待在今后的臨床研究中擴大樣本量，改進測序技術。腦脊液宏基因組第二代測序技術以其高通量、短片段測序優勢，可加快測序速度，增加樣本病原學陽性檢出的可能，從而彌補了傳統病原學檢測陽性發現率較低的劣勢，從而協助臨床對病原的診斷，使更多患者獲益。第二代測序技術不僅能夠鑒定病毒種類，還可以提供病毒的相對載量、基因分型、耐藥性等信息，但是目前缺乏行業判讀標準，檢測結果還需綜合生物學家、生物信息學分析專家、臨床醫師的意見進行判讀［13，16-17］。第二代測序技術作為一種新型分子診斷技術，雖然存在缺陷和不足，但相信隨著技術的發展和成熟，在未來作為常規應用于臨床感染篩查，將會大大提高臨床醫師對感染患者診斷效率和準確性。

利益沖突無