miR-155-5p靶向FNDC3B基因通過NF-κB信號通路調控骨關節炎軟骨細胞增殖和凋亡

謝進 舒莉莉 蘇虔 肖雄

骨性關節炎是退行性骨科疾病，關節軟骨進行性破壞，軟骨基質降解、滑膜炎癥、軟骨細胞凋亡等均是造成骨性關節炎的重要原因［1］。研究表明，miRNA影響骨關節炎的形成和發展，可作為骨關節炎的新型生物標志物和骨關節炎治療靶點［2］。研究報道，類風濕關節炎和骨關節炎患者滑膜組織中miR-155高表達［3］。類風濕關節炎患者血清中miR-155-5p高表達，其表達水平可作為類風濕關節炎診斷和活動度觀察指標［4］。miR-155還可抑制軟骨細胞的自噬［5］。Ⅲ型纖維連接蛋白結構域蛋白3B（fibronectin typeⅢdomain containing 3B，FNDC3B）定位于染色體3q26上，下調FNDC3B可降低舌鱗癌細胞的增殖及侵襲遷移能力［6］。然而miR-155-5p和FNDC3B對關節軟骨細胞增殖和凋亡的影響及miR-155-5p是否通過調控FNDC3B影響軟骨細胞增殖和凋亡還尚不清楚。白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）是一種促炎因子，其可誘導軟骨細胞凋亡［7］。因此，本實驗通過用白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）處理軟骨細胞建立骨關節炎模型，研究miR-155-5p對關節軟骨細胞增殖和凋亡的影響及其機制是否與FNDC3B有關。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2019年12月在本院行關節置換術患者的關節軟骨組織5例，其中男性3例，女性2例；年齡（62.1±5.23）歲；骨關節炎的診斷標準參照美國風濕病學會膝骨關節炎診斷標準［8］。排除免疫性及其他可影響關節炎病情的合并癥，所有患者均同意且知情。

1.2 材料

DMEM完全培養基（含10%胎牛血清）購自北京綠源伯德生物科技有限公司；青鏈霉素購自上海北諾生物科技有限公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；Ⅱ膠原酶購自大連美侖生物技術有限公司；白細胞介素-1β（IL-1β）購自武漢純度生物科技有限公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自美國Progema公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自碧云天生物技術研究所；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司。

1.3 軟骨細胞的分離培養

取關節軟骨組織，去除滑膜等其他組織后剪成碎塊，PBS沖洗3次后放入含0.25%的胰蛋白酶中消化30 min，再用0.1%的Ⅱ膠原酶消化30 min，消化后用200目篩網過濾分離，將細胞置于含1%青鏈霉素的DMEM完全培養基中于37℃、5%CO2下培養，取第2～3代細胞用于后續實驗。

1.4 細胞處理與分組

用10 ng/mL IL-1β處理軟骨細胞24 h建立關節炎軟骨細胞模型，記為IL-1β組，正常培養的細胞作為對照（NC）組；將anti-miR-NC、anti-miR-155-5p、pcDNA-NC、pcDNA-FNDC3B轉染至軟骨細胞中后用10 ng/ml IL-1β處理，記為1（IL-1β+antimiR-NC）組、2（IL-1β+anti-miR-155-5p）組、3（IL-1β+pcDNA-NC）組、4（IL-1β+pcDNA-FNDC3B）組；將anti-miR-155-5p與si-NC、si-FNDC3B共轉染至軟骨細胞中后用10 ng/ml IL-1β處理，記為5（IL-1β+anti-miR-155-5p+si-NC）組、6（IL-1β+antimiR-155-5p+si-FNDC3B）組。

1.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-155-5p和FNDC3B mRNA表達水平

按文獻方法［6］進行操作。miR-155-5p和FNDC3B分別以U6和GAPDH為內參。

1.6 蛋白質印跡（Western blot）法檢測FNDC3B、CyclinD1、Cleaved-caspase-3、p-p65、p-IκBα蛋白表達

按文獻方法［6］進行操作。其中一抗稀釋濃度為1∶1 000，二抗稀釋濃度為1∶2 000。

1.7 CCK-8檢測細胞存活率

培養48 h的細胞，每孔中加入10μL CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標儀檢測各組細胞490 nm波長處的吸光度值（OD）。細胞存活率（%）=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。實驗重復3次。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡及雙熒光素酶報告實驗驗證

培養48 h細胞，PBS漂洗2次，分別加Annexin V-FITC和PI各5μL，輕搖混勻，常溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

構建含有miR-155-5p結合位點的FNDC3B-3′UTR野生型及突變型報告基因載體，在軟骨細胞中轉染miR-155-5p mimics和FNDC3B野生型及突變型報告基因載體。轉染48 h后，根據試劑盒說明檢測熒光素酶活性。將miR-NC、miR-155-5p、anti-miR-NC、anti-miR-155-5p轉染至軟骨細胞中，按1.5中方法檢測FNDC3B蛋白表達。

1.9 統計學分析

采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，計量資料用（）表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 在IL-1β誘導的軟骨細胞中，miR-155-5p和FNDC3B表達情況

與對照組相比，IL-1β組軟骨細胞中miR-155-5p表達水平升高，FNDC3BmRNA和蛋白表達水平降低差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1，表1。

圖1 Western Blot檢測FNDC3B蛋白表達Figure 1 Western Blot detection of FNDC3B protein expression

表1 IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-155-5p和FNDC3B的表達（±s，n=9）Table 1 Expression of miR-155-5p and FNDC3B in chondrocytes induced by IL-1β（±s，n=9）

表1 IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-155-5p和FNDC3B的表達（±s，n=9）Table 1 Expression of miR-155-5p and FNDC3B in chondrocytes induced by IL-1β（±s，n=9）

組別NC IL-1β t值P值miR-155-5p 1.00±0.10 3.12±0.31 19.525 0.000 FNDC3B mRNA 1.03±0.11 0.36±0.03 17.629 0.000 FNDC3B protein 0.88±0.08 0.40±0.04 16.100 0.000

2.2 低表達miR-155-5p對IL-1β處理的軟骨細胞增殖和凋亡的影響

與對照組相比，IL-1β組軟骨細胞中miR-155-5p表達水平升高，CyclinD1表達水平降低，Cleaved-caspase-3表達水平升高，細胞存活率降低，細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與1組相比，2組軟骨細胞中miR-155-5p表達水平降低，CyclinD1表達水平升高，Cleaved-caspase-3表達水平降低，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低（P＜0.05）。見表2。

表2 低表達miR-155-5p促進軟骨細胞增殖，抑制其凋亡（±s，n=9）Table 2 Low expression of miR-155-5p promotes chondrocyte proliferation and inhibits apoptosis（±s，n=9）

表2 低表達miR-155-5p促進軟骨細胞增殖，抑制其凋亡（±s，n=9）Table 2 Low expression of miR-155-5p promotes chondrocyte proliferation and inhibits apoptosis（±s，n=9）

注：與NC比較，a P＜0.05；與IL-1β+anti-miR-NC比較，b P＜0.05。

組別NC IL-1β 1組2組F值P值miR-155-5p 1.00±0.12 3.21±0.32a 3.16±0.30 1.42±0.14b 211.488 0.000 CyclinD1 0.72±0.07 0.34±0.03a 0.36±0.04 0.61±0.06b 115.064 0.000 Cleaved-caspase-3 0.40±0.04 0.95±0.10a 0.98±0.08 0.58±0.05b 141.820 0.000細胞存活率（%）102.11±10.01 52.13±5.20a 49.05±4.91 83.12±8.30b 106.311 0.000細胞凋亡率（%）6.33±0.60 20.46±2.05a 18.26±1.80 9.86±0.98b 185.624 0.000

2.3 高表達FNDC3B對IL-1β處理的軟骨細胞增殖和凋亡的影響

與3組相比，4組軟骨細胞中FNDC3B表達水平升高，CyclinD1表達水平升高，Cleaved-caspase-3表達水平降低，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低（P＜0.05）。表3，見圖2。

表3 高表達FNDC3B對IL-1β處理的軟骨細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Table 3 Effect of high expression of FNDC3B on IL-1β-treated chondrocyte proliferation and apoptosis（±s，n=9）

表3 高表達FNDC3B對IL-1β處理的軟骨細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Table 3 Effect of high expression of FNDC3B on IL-1β-treated chondrocyte proliferation and apoptosis（±s，n=9）

組別3組4組t值P值FNDC3B 0.42±0.04 0.74±0.07 11.907 0.000 CyclinD1 0.34±0.03 0.60±0.06 11.628 0.000 Cleaved-caspase-3 0.99±0.10 0.55±0.03 12.643 0.000細胞存活率（%）50.77±5.10 89.05±8.90 11.196 0.000細胞凋亡率（%）19.89±1.95 10.66±1.08 12.422 0.000

圖2 Western Blot檢測FNDC3B、CyclinD1和Cleavedcaspase-3的蛋白表達Figure 2 Western Blot detection of protein expression of FNDC3B，CyclinD1 and Cleaved-caspase-3

2.4 miR-155-5p靶向FNDC3B

starbase數據庫預測顯示miR-155-5p與FNDC3B存在結合位點（圖3A）。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC組相比，miR-155-5p組中轉染FNDC3B野生型載體的細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而轉染FNDC3B突變型載體的細胞熒光素酶活性無顯著差異（表4）。與miRNC組相比，miR-155-5p組FNDC3B表達水平降低（P＜0.05），與anti-miR-NC組相比，anti-miR-155-5p組FNDC3B表達水平升高（P＜0.05）（圖3B）。

圖3 miR-155-5p靶向調控FNDC3B表達Figure 3 miR-155-5p targets FNDC3B expression

表4 miR-NC或miR-155-5p與報告質粒共轉染軟骨細胞后雙熒光素酶活性檢測（±s，n=9）Table 4 Detection of double luciferase activity after cotransfection of miR-NC or miR-155-5p with reporter plasmid（±s，n=9）

表4 miR-NC或miR-155-5p與報告質粒共轉染軟骨細胞后雙熒光素酶活性檢測（±s，n=9）Table 4 Detection of double luciferase activity after cotransfection of miR-NC or miR-155-5p with reporter plasmid（±s，n=9）

組別miR-NC miR-155-5p t值P值熒光素酶活性WT 1.00±0.11 0.41±0.04 15.122 0.000 MUT 1.03±0.10 1.01±0.12 0.384 0.706

2.5 低表達FNDC3B可以部分逆轉miR-155-5p低表達對IL-1β處理的軟骨細胞增殖和凋亡的影響

與5組相比，6組FNDC3B表達水平降低，CyclinD1表達水平降低，Cleaved-caspase-3表達水平升高，細胞存活率降低，細胞凋亡率升高（P＜0.05）見圖4，表5。

圖4 Western Blot檢測FNDC3B、CyclinD1和Cleavedcaspase-3蛋白表達Figure 4 Western Blot detection of FNDC3B,CyclinD1 and Cleaved-caspase-3 protein expression

2.6 IL-1β處理的軟骨細胞中NF-κB信號通路相關蛋白的表達

與1組相比，2組軟骨細胞中p-p65、p-IκBα表達水平降低（P＜0.05）；與5組相比，6組軟骨細胞中p-p65、p-IκBα表達水平升高（P＜0.05）。見圖5。

表5 低表達FNDC3B可以部分逆轉miR-155-5p低表達對IL-1β處理的軟骨細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Table 5 Low expression of FNDC3B can partially reverse the effect of miR-155-5p low expression on IL-1β-treated chondrocyte proliferation and apoptosis（±s，n=9）

表5 低表達FNDC3B可以部分逆轉miR-155-5p低表達對IL-1β處理的軟骨細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Table 5 Low expression of FNDC3B can partially reverse the effect of miR-155-5p low expression on IL-1β-treated chondrocyte proliferation and apoptosis（±s，n=9）

組別5組6組t值P值FNDC3B 0.74±0.07 0.53±0.05 7.324 0.000 CyclinD1 0.63±0.06 0.42±0.04 8.737 0.000 Cleaved-caspase-3 0.55±0.05 0.86±0.08 9.858 0.000細胞存活率（%）84.55±8.50 61.07±6.11 6.729 0.000細胞凋亡率（%）9.03±0.90 15.67±1.53 11.222 0.000

圖5 Western Blot檢測p-p65、p-IκBα蛋白表達Figure 5 Western Blot detection of p-p65 and p-IκBα protein expression

3 討論

關節軟骨破壞是骨關節炎重要特征，軟骨細胞凋亡是軟骨破壞的主要原因，其在骨關節炎的發病中起重要作用［9］。研究表明miRNA參與了骨關節炎軟骨細胞增殖、凋亡及細胞炎癥等［10］。研究報道塞來昔布治療后膝骨關節炎患者中miR-155-5p表達水平降低［11］。miR-155-5p表達水平的降低改善了膝骨關節炎［12］。本實驗結果顯示，IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-155-5p高表達；抑制miR-155-5p表達，IL-1β誘導的軟骨細胞中CyclinD1表達水平升高，Cleaved-caspase-3表達水平降低，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低。說明抑制miR-155-5p表達可促進IL-1β誘導的軟骨細胞增殖，抑制細胞凋亡。為進一步研究miR-155-5p影響軟骨細胞增殖、凋亡的機制，本實驗預測了miR-155-5p可能的靶mRNA，結果顯示，miR-155-5p可靶向調控FNDC3B，本實驗結果顯示，IL-1β誘導的軟骨細胞中FNDC3B低表達；過表達FNDC3B可促進IL-1β誘導的軟骨細胞增殖，抑制細胞凋亡。且本實驗還發現低表達FNDC3B可以部分逆轉miR-155-5p低表達對IL-1β處理的軟骨細胞增殖、凋亡的影響。提示，miR-155-5p可能通過調控FNDC3B影響軟骨細胞增殖和凋亡。

研究表明核因子-κB（Nuclear factorκB，NFκB）信號通路參與并調控軟骨細胞的增殖、分化、凋亡，在骨關節炎的發生、發展中扮演著十分重要的角色［13］。槲皮素通過抑制NF-κB激活減弱炎癥環境下軟骨細胞基質降解和細胞凋亡，起到保護軟骨的作用［14］。miR-155-5p可通過調控NF-κB維持類風濕性關節炎的炎癥穩態［15］。本實驗結果顯示，抑制miR-155-5p表達，p-p65、p-IκBα表達水平顯著降低；說明抑制miR-155-5p表達可抑制NFκB信號通路激活。而低表達FNDC3B部分逆轉了miR-155-5p低表達對NF-κB信號通路的抑制作用。提示，miR-155-5p可能通過調控FNDC3B進而影響NF-κB信號通路。

綜上所述，抑制miR-155-5p表達可能通過上調FNDC3B促進IL-1β誘導的軟骨細胞增殖，抑制細胞凋亡，且其可能與NF-κB信號通路有關。