miR-142-5p對癲癇發作后神經元損傷的作用機制

趙利 李海燕

癲癇屬于慢性腦功能障礙性疾病，神經元細胞凋亡、神經再生、神經炎癥及神經功能異常等均可導致癲癇的發生［1-2］。已有報道指出微小RNA（miRNA）異常表達與癲癇發生及發展密切相關［3］。微小RNA-142-5p（miR-142-5p）在大鼠癲癇模型中表達升高，但關于其具體作用機制尚未闡明［4］。Apelin（APLN）是一種血管活性肽并可調控多種生物學過程，并可降低神經興奮性緩解癲癇發作［5］。利用TargetScan預測發現APLN可能是miR-142-5p的靶基因。因此，本研究主要探討miR-142-5p在癲癇發作后神經元細胞損傷中的作用及其對PI3K/AKT信號通路的影響，并驗證APLN是否為miR-142-5p的靶基因，為揭示癲癇發病機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠神經元細胞購自上海康朗生物科技有限公司。胎牛血清、RPMI 1640培養基、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；蛋白提取試劑盒、反轉錄試劑盒、RNAisoPlus反轉錄試劑盒與實時熒光定量PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；兔抗鼠APLN抗體購自美國Abcam公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax、β-actin單克隆抗體均購自上海賽信通生物試劑有限公司；miR-142-5p抑制劑（anti-miR-142-5p）（AAAGAGACCGGUUCACGUGA）、miR-142-5p抑制劑的陰性對照anti-miR-con（CAGUACUUUUGUGUAGUACAA）、miR-142-5p模擬物（mimics）（UCACGUGAACCGGUCUCUUU）、miR-142-5p過表達的陰性對照miR-con（UUCUCCGAACGUGUCACGUUU）均購自百奧邁科生物技術有限公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自上海陽光生物科技有限公司；APLN小干擾RNA（si-APLN）（AGGGAGGTCGGAGGAAAUU）、亂序無意義陰性對照序列（si-con）（CAGUAAUUUAUGCAAAGCA）均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Santa Cruz公司；GSH與MDA ELISA檢測試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 構建大鼠海馬神經元癲癇模型

正常維持液內培養大鼠海馬神經元，14 d后棄掉原維持液，用低鎂細胞外液清洗，隨后用低鎂外液培養（每孔2 mL），參照相關文獻構建大鼠海馬神經元癲癇模型［6］，根據氧化應激水平升高預示模型構建成功。將未經處理的正常神經元細胞作為正常對照組，同時將大鼠海馬神經元癲癇模型大鼠神經元細胞為癲癇細胞模型組。

1.2.2 細胞轉染及分組

收集處于對數生長期癲癇大鼠神經細胞分為anti-miR-142-5p組（轉染anti-miR-142-5p）、antimiR-con組（轉染anti-miR-con）、miR-142-5p組（轉染miR-142-5p mimics）、miR-con組（轉染miRcon），NC組（未經任何處理的細胞）；anti-miR-142-5p+si-con組（共轉染anti-miR-142-5p與si-con）、anti-miR-142-5p+si-APLN組（anti-miR-142-5p與si-APLN），參照Lipofectamine2000轉染試劑盒進行操作。轉染6 h更換含有10%胎牛血清及雙抗的RPMI 1640完全培養基，繼續培養48 h后收集細胞。

1.2.3 qRT-PCR檢測細胞中miR-142-5p、APLN mRNA表達水平

取各組神經元細胞，按照Trizol試劑提取細胞總RNA，參照反轉錄試劑盒合成cDNA，根據實時熒光定量PCR試劑盒說明書檢測miR-142-5p、APLN mRNA相對表達量。采用2-ΔΔCt法計算miR-142-5p、APLN mRNA相對表達量。miR-142-5p正向引物5′-AACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAAT-3′；APLN正向引物5′-GGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAAT-3′。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測APLN、Bax、Bcl-2蛋白表達

用蛋白裂解液裂解各組神經元細胞，離心細胞后提取細胞總蛋白，經SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜，封閉1 h，加入蛋白一抗稀釋液，4℃孵育24 h后加入二抗稀釋液（1∶5 000），滴加ECL顯影，置于凝膠成像系統成像，觀察蛋白條帶灰度值。

1.2.5 檢測GSH與MDA含量

取各組神經元細胞，胰蛋白酶消化細胞，4℃條件下，3 000 r/min轉速離心10 min（離心半徑5 cm），吸取1 mL上清液利用ELISA檢測GSH與MDA含量，同時需繪制標準品線性回歸曲線，根據曲線方程計算樣本中GSH與MDA濃度值。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集轉染48 h后各組癲癇大鼠神經細胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌，加入Binding Buffer 200μL重懸細胞，依次分別加入5μL Annexin V-FITC與PI，充分混勻后置于室溫下避光孵育15 min，加入300μL Binding Buffer，利用流式細胞儀檢測各組神經細胞凋亡情況。

1.2.7 熒光素酶報告基因檢測

TargetScan預測miR-142-5p的靶基因可能是APLN，構建野生型載體APLN-WT、突變型載體APLN-MUT，取對數生長期癲癇大鼠神經細胞共轉染APLN-WT（100 ng）與miR-142-5p mimics或miR-con，共轉染APLN-MUT與miR-142-5p mimics或miR-con，繼續培養48 h，根據雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書檢測各組細胞熒光素酶活性值。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0統計學軟件分析數據，計量資料以（）表示，數據均符合正態分布，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-142-5p和APLN在大鼠癲癇神經細胞中的表達

NC組與癲癇細胞模型組大鼠神經細胞中miR-142-5p的表達水平分別為（1.03±0.11）、（4.28±0.37）；APLN mRNA的表達水平分別為（1.03±0.21）、（0.62±0.06）；APLN蛋白相對表達量分別為（0.54±0.06）、（0.28±0.04），NC組與癲癇細胞模型組相比差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 Western blot檢測大鼠癲癇神經細胞APLN蛋白表達Figure 1 Western blot analysis of APLN protein expression in rat epilepsy neurons

2.2 大鼠神經細胞干擾miR-142-5p表達對大鼠癲癇神經細胞氧化應激參數GSH和MDA含量的影響

相較于NC組、anti-miR-con組，anti-miR-142-5p組大鼠神經細胞中GSH含量明顯增加，而MDA含量明顯減少（P＜0.05），見圖2。

2.3 干擾miR-142-5p表達對大鼠癲癇神經細胞凋亡的影響

圖2 檢測大鼠神經細胞中GSH、MDA含量（48 h）Figure 2 Detection of GSH and MDA in rat nerve cells（48 h）

anti-miR-142-5p組癲癇大鼠神經細胞凋亡率與NC組、anti-miR-con組比較差異有統計學意義（圖3D、3E）（P＜0.05），進一步檢測發現anti-miR-142-5p組癲癇大鼠神經細胞中Bcl-2蛋白表達水平顯著高于NC組、anti-miR-con組（P＜0.05），而Bax蛋白表達水平降低（P＜0.05）（圖3A、3B、3C）。

圖3 干擾miR-142-5p表達后對大鼠癲癇神經細胞凋亡的影響Figure 3 Effect of interference with miR-142-5p expression on apoptosis of rat epileptic neurons

2.4 miR-142-5p靶向APLN

靶基因預測結果顯示APLN是miR-142-5p的靶基因，見圖4A。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，共轉染APLN-WT與miR-142-5p mimics后，癲癇大鼠神經細胞熒光素酶活性較轉染miR-con組明顯下降（P＜0.05），而共轉染APLN-MUT與miR-142-5p mimics后，癲癇大鼠神經細胞熒光素酶活性較轉染miR-con組無統計學意義（P＞0.05），見表1。轉染miR-142-5p mimics后，癲癇大鼠神經細胞中APLN蛋白的表達水平較轉染miR-con組降低（P＜0.05），而轉染anti-miR-142-5p后，癲癇大鼠神經細胞中APLN蛋白的表達水平較轉染anti-miRcon組升高（P＜0.05），見圖4B、表2。

2.5 沉默APLN部分逆轉干擾miR-142-5p對大鼠癲癇神經細胞的保護作用

圖4 miR-142-5p與APLN靶向序列和調控APLN蛋白表達Figure 4 miR-142-5p and APLN targeting sequences and regulation of APLN protein expression

表1 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=3）Table 1 Dual luciferase reporter experiment（±s，n=3）

表1 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=3）Table 1 Dual luciferase reporter experiment（±s，n=3）

分組miR-con miR-142-5p t值P值APLN-WT 1.00±0.12 0.47±0.06 6.842 0.002 APLN-MUT 0.96±0.09 1.17±0.12 2.425 0.072

表2 miR-142-5p調控APLN蛋白的表達（±s，n=3）Table 2 miR-142-5p regulates the expression of APLN protein（±s，n=3）

表2 miR-142-5p調控APLN蛋白的表達（±s，n=3）Table 2 miR-142-5p regulates the expression of APLN protein（±s，n=3）

分組miR-con miR-142-5p anti-miR-con anti-miR-142-5p F值P值APLN蛋白0.61±0.08 0.34±0.05 0.64±0.07 0.92±0.08 33.401 0.000

如圖5、表3所示，共轉染anti-miR-142-5p與si-APLN后，癲癇大鼠神經細胞凋亡率較共轉染anti-miR-142-5p+si-con組升高，差異有統計學意義（P＜0.05），Bax蛋白表達水平升高，而Bcl-2蛋白表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖5 Western blot檢測大鼠癲癇神經細胞Bax和Bcl-2表達Figure 5 Western blot analysis of Bax and Bcl-2 expression in rat epileptic neurons

表3 沉默APLN部分逆轉干擾miR-142-5p對大鼠癲癇神經細胞APLN、Bax和Bcl-2的表達以及細胞凋亡率的影響（±s，n=3）Table 3 Effect of silencing APLN partial reversal of miR-142-5p on the expression of APLN,Bax and Bcl-2 and apoptosis rate in rat epileptic neurons（±s，n=3）

表3 沉默APLN部分逆轉干擾miR-142-5p對大鼠癲癇神經細胞APLN、Bax和Bcl-2的表達以及細胞凋亡率的影響（±s，n=3）Table 3 Effect of silencing APLN partial reversal of miR-142-5p on the expression of APLN,Bax and Bcl-2 and apoptosis rate in rat epileptic neurons（±s，n=3）

組別anti-miR-con anti-miR-142-5p anti-miR-142-5p+si-con anti-miR-142-5p+si-APLN F值P值APLN 0.39±0.04 0.79±0.08 0.83±0.07 0.61±0.06 29.358 0.000 Bax 0.64±0.06 0.36±0.04 0.33±0.03 0.51±0.06 25.485 0.000 Bcl-2 0.27±0.03 0.59±0.06 0.56±0.07 0.35±0.05 24.832 0.000凋亡率（%）19.35±1.13 12.37±0.89 11.41±1.08 15.38±0.97 36.699 0.000

表4 APLN和miR-142-5p表達對大鼠癲癇神經細胞AKT信號通路相關蛋白p-AKT和p-GSK3β的表達（±s，n=3）Table 4 Expression of APLN and miR-142-5p on AKT signaling pathway-associated proteins p-AKT and p-GSK3β in rat epileptic neurons（±s，n=3）

表4 APLN和miR-142-5p表達對大鼠癲癇神經細胞AKT信號通路相關蛋白p-AKT和p-GSK3β的表達（±s，n=3）Table 4 Expression of APLN and miR-142-5p on AKT signaling pathway-associated proteins p-AKT and p-GSK3β in rat epileptic neurons（±s，n=3）

組別anti-miR-con anti-miR-142-5p anti-miR-142-5p+si-con anti-miR-142-5p+si-APLN F值P值p-AKT 0.44±0.05 0.67±0.08 0.71±0.07 0.52±0.06 11.058 0.003 p-GSK3β 0.31±0.05 0.69±0.08 0.72±0.07 0.46±0.05 28.000 0.000

3 討論

miR-142-5p在動脈粥樣硬化組織中呈高表達，其可通過抑制靶基因轉化生長因子β2（TGF-β 2）表達進而誘導人巨噬細胞凋亡［7］。miR-142-5p通過靶向Ulk1進而破壞豬血凝性腦脊髓炎病毒感染的神經元形態［8］。本研究結果表明癲癇細胞模型組神經細胞中miR-142-5p的表達水平顯著升高，干擾miR-142-5p表達后癲癇大鼠神經細胞氧化應激指標GSH含量顯著升高，而MDA含量顯著降低。GSH屬于抗氧化系統酶類，而MDA屬于氧化系統酶類，氧化系統與抗氧化系統失衡可促使腦組織或細胞損傷［9］。提示干擾miR-142-5p表達可通過抑制神經細胞氧化應激反應進而減緩神經元損傷程度。Bcl-2可抑制細胞凋亡，而Bax可促進細胞凋亡［10］。本研究結果發現，干擾miR-142-5p表達后，癲癇大鼠神經細胞中Bcl-2表達水平明顯升高，而Bax表達水平顯著降低。提示干擾miR-142-5p表達可通過減輕神經細胞氧化應激反應及抑制細胞凋亡進而減緩癲癇大鼠神經元損傷。

APLN可在多種組織中表達，并可參與氧化應激、炎癥反應及心肌缺血再灌注損傷等多種生理病理過程［11］。APLN可作為內源性神經保護因子，并可在神經元遭受興奮性毒性損傷時發揮抗神經細胞凋亡的作用［12］。與上述研究結果相似，本研究結果表明癲癇細胞模型組中神經細胞中APLN的表達水平明顯降低，進一步證實miR-142-5p可負向調控靶基因APLN表達，anti-miR-142-5p與si-APLN共轉染癲癇大鼠神經細胞后，細胞凋亡率明顯增加。提示干擾miR-142-5p表達可通過上調APLN表達進而對癲癇發作后神經元損傷發揮保護作用。

綜上所述，干擾miR-142-5p表達可能通過調控APLN的表達進而抑制癲癇發作后神經細胞凋亡，并可能通過抑制神經細胞氧化應激反應進而對神經元損傷發揮保護作用，其可能通過激活AKT信號通路而發揮作用，為進一步研究miR-142-5p在癲癇發病過程中的作用機制奠定理論基礎，為臨床診斷及治療提供一定依據。