抗癌烷化劑三溴基丙酮酸對秀麗隱桿線蟲衰老指標及壽命的影響

魏倩囡 王素娟 劉佳奇

[摘要]目的 探討不同濃度的三溴基丙酮酸（3-BrPA）對秀麗隱桿線蟲壽命的作用以及相關衰老指標的測試，系統評估其對生命狀態的影響。方法 選取同期化的秀麗隱桿線蟲作為實驗對象，選擇3.125、6.250、12.500、25.000 mmol/L的3-BrPA作為實驗組，0.000 mmol/L作為對照組。線蟲壽命實驗中，每個濃度均選擇135條線蟲，記錄并繪制各個實驗組和對照組的生存曲線;線蟲吞咽能力實驗每組均選擇10條線蟲，記錄并繪制反映線蟲衰老程度的吞咽速率圖。結果 秀麗隱桿線蟲的壽命實驗和吞咽能力實驗結果均顯示，3.125、25.000 mmol/L實驗組低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;而6.250、12.500 mmol/L實驗組與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論 3.125、25.000 mmol/L濃度的3-BrPA對秀麗隱桿線蟲顯示一定程度的損傷;而6.250、12.500 mmol/L濃度的3-BrPA對秀麗隱桿線蟲并沒有顯示明顯的毒副作用，且與對照組線蟲相比，其線蟲壽命并未縮短。產生此特殊現象或許和秀麗隱桿線蟲體內丙酮酸濃度及飲食限制（DR）機制有關，具體原因仍在進一步研究。

[關鍵詞]抗癌烷化劑;三溴基丙酮酸;秀麗隱桿線蟲;抗衰老;毒副作用

[中圖分類號] R285.5 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-4721（2020）6（b）-0004-04

[Abstract] Objective To explores the influence of different concentrations of 3-Bromopyruvate （3-BrPA） on the lifespan of Caenorhabditis elegans and tests of related aging indicators to systematically assess its impact on life conditions. Methods The same period of Caenorhabditis elegans was selected as the experimental object， 3-BrPA of 3.125， 6.250， 12.500 and 25.000 mmol/L were selected as the experimental group， and 0.000 mmol/L were selected as the control group. A total of 135 cases of Caenorhabditis elegans were selected for each concentration in the nematode life test group， and the survival curves of the each experimental group and the control group were recorded and plotted in the nematode swallowing capacity experiment， 10 cases of Caenorhabditis elegans were selected in the each group， and the swallowing rate graph reflecting the aging degree of the Caenorhabditis elegans was recorded and plotted. Results Both Caenorhabditis elegans lifespan test and pharynx pumping ability test results showed that which in the experimental group of 3-BrPA of 3.125， 25.000 mmol/L were lower than those of the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. There were no significant differences in the Caenorhabditis elegans lifespan test and pharynx pumping ability test results between the the experimental group of 3-BrPA of 6.250， 12.500 mmol/L and the control group （P>0.05）. Conclusion 3-BrPA at 3.125 and 25.000 mmol/L showed a certain degree of damage to Caenorhabditis elegans; However， 3-BrPA at the concentrations of 6.250 and 12.500 mmol/L aren′t show significant toxic and side effect on Caenorhabditis elegans， and compared with the control group， the lifespan of the Caenorhabditis elegans is not shortened and prolonged. The occurrence of this special phenomenon may be related to the pyruvate concentration in the body of Caenorhabditis elegans and the mechanism of dietary restriction （DR）. The specific reasons are still being further studied.

[Key words] Anticancer alkylating; Agent 3-Bromopyruvate; Caenorhabditis elegans; Anti-aging; Toxic side effect

隨著全球癌癥發生率和死亡率的逐年提高，癌癥已經成為人類死亡的重要原因之一[1]。在眾多抗癌藥物中，烷化劑是最早應用于癌癥治療的藥物，也是目前被廣泛應用于腫瘤化學治療的常規藥物。在長期臨床實踐中發現，單功能烷化劑普遍存在治療效率較低、毒副作用強等缺陷，很難達到理想的化療效果[3]。近年來，三溴基丙酮酸（3-BrPA）作為新一代高效低毒烷化劑，通過抑制腫瘤細胞糖酵解過程中的己糖激酶Ⅱ（HK2）和甘油醛-3-脫氫酶（GAPDH），協作誘導細胞內ATP耗竭，從而導致腫瘤細胞凋亡[4-5]。同時，其抑制了琥珀酸脫氫酶（SDH）的活性，導致細胞內氧化還原狀態失衡[6]。3-BrPA因其細胞毒性小，作用范圍廣，對多種腫瘤細胞敏感，因而被認為是目前臨床上最有前途的抗癌烷化劑[7]，而目前關于3-BrPA對生命體生存狀態（壽命）的系統評估尚未見深入報道。

秀麗隱桿線蟲是衰老研究的經典模式生物，具有相對短的壽命（在20℃下2～3周）、保守的發育模式、遺傳操作容易、測序完全的基因組幾個顯著特點，且其蛋白質序列中約有83%與人類同源[8]，同時有著極為豐富的遺傳學和發育生物學研究背景，是研究毒理學或人類疾病的良好生物模型[9-10]。所以本研究選擇秀麗隱桿線蟲作為模型生物，以評估不同濃度的3-BrPA對秀麗隱桿線蟲生存狀態的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1線蟲株和菌株 ?本實驗所選秀麗隱桿線蟲野生型N2和大腸桿菌OP50均由美國國家衛生研究院衰老研究所提供。

1.1.2試劑與儀器 ?3-BrPA、5-氟尿苷（5-fluoro-2′-deoxyuridine，FUDR）購自Sigma Aldrich有限公司，氯化鈉（分析純）、無水氯化鈣（分析純）、無水硫酸鎂（分析純）、無水乙醇（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、N，N-二甲基甲酰胺（分析純）、磷酸氫二鉀（分析純）、疊氮鈉、制霉菌素、瓊脂粉、LB營養瓊脂購自國藥集團化學試劑有限公司;蛋白胨購自BD公司。體視顯微鏡SZ61型購自日本奧林巴斯（OLYMPUS）公司;超凈工作臺為新加坡ESCO實驗室儀器設備;生化培養箱購自上海一恒科學儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1基礎配方 ?①NGM固體培養基：NaCl 3 g、瓊脂粉18 g、胰蛋白胨2.5 g加入975 ml蒸餾水，121℃滅菌20 min，冷卻至60℃左右，無菌條件下加入1 ml的5 mg/ml膽固醇乙醇溶液、1 ml的1 mol/L CaCl2、1 ml的1 mol/L MgSO4、0.67 ml 200 mg/ml硫酸鏈霉素溶液、0.17 ml的40 mg/ml制霉菌素DMF溶液和25 ml的1 mol/L pH 6.0的磷酸鉀緩沖液。混合均勻后鋪培養皿，冷卻備用。②S-basal緩沖液：NaCl 5.85 g、K2HPO4 1 g、KH2PO4 6 g加蒸餾水至1 L，高壓滅菌備用。③LB液體培養基：LB肉湯10 g加入蒸餾水至500 ml，121℃高壓滅菌20 min。④LB固體培養基：LB營養瓊脂16 g加入蒸餾水至500 ml，121℃高壓滅菌20 min，冷卻至60℃時，加入200 mg/ml硫酸鏈霉素溶液0.33 ml。

1.2.2菌株培養 ?從-80℃冰箱中取出大腸桿菌OP50，用滅菌后的牙簽鈍端輕輕蘸取OP50，點在LB固體培養基上，用接種環在LB固體培養基上涂布OP50，涂布多個位置，然后將涂布后的LB培養基放置37℃恒溫箱培養15 h。次日用接種環選取LB培養基上的單個菌株，涂在LB液體培養基的瓶口處，輕輕搖晃培養瓶，讓菌株均勻，之后置于37℃恒溫箱培養8～10 h。將培養后的OP50菌液滴加在提前制備好的NGM培養基上，置于超凈工作臺中生長至實驗所需的厚度。

1.2.3線蟲一般培養及同期化 ?N2：選取性成熟的成蟲15條，挑入至食物充足無污染的NGM培養基。將培養基放在25℃恒溫箱培養5 h，剔除成蟲后轉移到15℃恒溫箱繼續培養，直至卵生長到L4期;之后將L4期線蟲挑入新的加入FUDR和不同濃度3-BrPA的食物充足的NGM培養基上，此時線蟲記為Adult 0 d齡，然后將NGM培養基放在25℃恒溫箱96 h，再轉移到20℃恒溫箱繼續培養。

1.2.4線蟲壽命實驗 ?選取同期化培養的野生型N2線蟲進行壽命實驗，實驗中梯度給藥，梯度給藥濃度為0.000、3.125、6.250、12.500和25.000 mmol/L，共5個梯度，0.000 mmol/L為對照組，其余為實驗組，每組均選取135條線蟲。濃度選擇參照前期預實驗結果，從最高濃度100.000 mmol/L以2倍遞減至最小濃度3.125 mmol/L，預實驗結果顯示選擇50.000、100.000 mmol/L時，線蟲會在12～15 d或更短時間內大批量死亡，不具有實驗入組的價值。所有實驗均重復3次，結果取平均值。

1.2.5線蟲吞咽能力實驗 ?選取同期化培養的野生型N2線蟲給藥時間的第5天和第10天進行吞咽能力實驗，實驗中梯度給藥，梯度給藥濃度為0.000、3.125、6.250、12.500、25.000 mmol/L，共5個梯度，0.000 mmol/L為對照組，其余為實驗組，每組均選取10條線蟲。計時1 min，500倍顯微鏡下記錄線蟲咽部的吞咽次數，實驗重復3次，結果取平均值。

1.3統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組樣本均數的兩兩比較采用ANOVA分析（方差齊時，采用LSD-t檢驗，方差不齊時，采用Games-Howell法），以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 lifespan的結果

3.125、25.000 mmol/L實驗組和對照組比較，實驗組線蟲壽命縮短，差異有統計學意義（P<0.05）;6.250、12.500 mmol/L實驗組和對照組比較，實驗組線蟲壽命并無縮短，差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。3-BrPA給藥濃度為0.000、3.125、6.250、12.500、25.000 mmol/L時秀麗隱桿線蟲壽命曲線見圖1（封三）。

2.2 3-BrPA對秀麗隱桿線蟲吞咽能力的影響

在給藥的第5天和第10天測試線蟲的吞咽速率，結果顯示3.125和25.000 mmol/L的實驗組線蟲低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;6.250、12.500 mmol/L實驗組線蟲與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）（圖2）。

3討論

Wood等[11]發現，在大腸桿菌OP50中加入抗生素會影響線蟲壽命，為避免3-BrPA藥物自身抗菌性會影響壽命實驗結果，因此在實驗組和對照組均加入2 mmol/L的卡那霉素。線蟲壽命實驗結果顯示，3-BrPA的給藥濃度為3.125 mmol/L或25.000 mmol/L時，線蟲壽命縮短，提示藥物自身毒性會損傷線蟲壽命。3-BrPA的給藥濃度在6.250、12.500 mmol/L時，線蟲壽命并未縮短，提示在特定濃度線蟲壽命并不受藥物損傷。

線蟲吞咽能力實驗是線蟲抗衰老實驗的一種，正常生理狀況下，線蟲的吞咽速率反映線蟲進食的能力，進而間接反映線蟲的衰老程度。線蟲吞咽能力結果顯示，與對照組比較，3-BrPA的給藥濃度為3.125 mmol/L或25.000 mmol/L時，線蟲吞咽速率下降，衰老加速;而當3-BrPA的給藥濃度在6.250、12.500 mmol/L時，線蟲的吞咽速率無明顯變化，衰老無明顯加速。線蟲吞咽能力實驗結果與壽命實驗結果一致。

3-BrPA在3.125 mmol/L或25.000 mmol/L濃度時，線蟲壽命縮短，其加速衰老的機制可能與抗腫瘤的機制一致。3-BrPA通過抑制糖酵解過程的酵解酶阻止細胞得到能量，從而誘導腫瘤細胞凋亡。3-BrPA的抗腫瘤作用在體內外均被證實[12-14]，最新研究顯示，3-BrPA可以抑制多種腫瘤的惡性發展[15-17]。3-BrPA在6.250、12.5000 mmol/L濃度時，線蟲壽命并不受影響，衰老并未加速，與抗腫瘤機制及此前的毒性實驗結果不一致，此特殊現象或許與丙酮酸水平及飲食限制（DR）有關。

Mouchiroud等[19]的實驗顯示，丙酮酸穩態在秀麗隱桿線蟲的壽命控制中起著核心作用，丙酮酸增多可以在一定程度上延長秀麗隱桿線蟲的壽命。因此，除了高濃度的3-BrPA自身的毒性會導致秀麗隱桿線蟲壽命縮短外（付喜梅[18]等的研究認為，高濃度的3-BrPA對線蟲具有毒性作用，低濃度的3-BrPA能抑制秀麗隱桿線蟲幼蟲發育），3-BrPA引起的丙酮酸減少可能是導致秀麗隱桿線蟲壽命縮短的其中一個原因。DR是延長壽命的重要干預措施，即減少熱量攝入而無營養不良[20]。Maeda等[21-23]的研究顯示，DR不僅可以延長壽命，而且可以延緩與年齡有關的疾病如癌癥的發生，而3-BrPA引起的細胞內ATP攝入減少，類似于DR的狀態。在特定的濃度下，3-BrPA可能通過丙酮酸模擬DR狀態作用于某個特定的基因，最終導致在特殊濃度范圍內秀麗隱桿線蟲的壽命無損傷，具體機制目前尚無法確定。

對于此種現象涉及的3-BrPA的具體作用機制，接下來將會進一步加大實驗的樣本量，并深入測試與丙酮酸相關基因及上下游調節機制，以期對糖代謝及衰老與長壽等研究領域發現新的機制，并對進一步開發新的抗腫瘤藥物提供啟示性線索。

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（收稿日期：2020-01-13 ?本文編輯：祁海文）